Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos
Summary
Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.
Abstract
A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em uma escala de tempo rápida permite que os padrões de neurotransmissão para ser ligado a comportamentos específicos ou manipulações; uma poderosa ferramenta na elucidação de mecanismos e circuitos subjacentes. Enquanto a técnica do microdialysis tem sido usada há décadas para medir praticamente qualquer analito de interesse no cérebro, esta técnica é limitada em resolução temporal. Alternativamente, voltametria cíclica de varredura rápida é temporalmente precisos e extremamente sensível; no entanto, porque esse método tecnicamente difícil depende do electroactivity do analito de interesse, é eliminada a possibilidade de detectar substâncias nonelectroactive (por exemplo, o glutamato neurotransmissor). Este documento detalha o uso de um sistema turn-key que combina potencial fixo amperometry e biosensing enzimático para medir os neurotransmissores tanto eletroativos e nonelectroactive com precisão temporal. O emparelhamento destas duas poderosas técnicas permite a medição de tônico e neurotransmissão fásicos com relativa facilidade e permite a gravação de vários neurotransmissores simultaneamente. O objetivo deste manuscrito é demonstrar o processo de medição de dopamina e glutamato neurotransmissão no vivo usando um comportamento naturalmente gratificante (ou seja, comportamento sexual) em hamsters femininos, com o objetivo de exibir a viabilidade técnica deste teste para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.
Introduction
A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em animais comportamento acordados permite que os pesquisadores de vincular comportamentos específicos com padrões espaciais e temporais da neurotransmissão-uma poderosa ferramenta para investigar os mecanismos e circuitos subjacentes a ambos naturais e comportamentos operante em tempo real. Historicamente, o microdialysis tem sido empregado para medir substâncias eletricamente reativas e não reactivas no meio extracelular do cérebro1. Esta técnica usa um fluxo contínuo de uma solução aquosa de composição iônica semelhante ao fluido extracelular, através de uma sonda de microdialysis composta de uma haste pequena com uma dica de uma membrana de fibra oca semipermeable2. Após a inserção da sonda, neurotransmissores ou outros analitos de interesse podem atravessar a membrana semipermeável por difusão passiva, antes de ser coletados em intervalos para posterior análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), um técnica de química analítica, comumente utilizada para separar, identificar e quantificar os componentes em uma mistura heterogênea de3.
Embora microdialysis é uma técnica sensível que pode ser usada para medir praticamente qualquer substância de interesse, a resolução temporal é baixa, com taxas de amostragem máxima da ordem de dezenas de minutos1,2minutos. A invenção de varredura rápida voltametria cíclica (FSCV), uma técnica que se baseia no potencial redox de espécies eletroativos, pode elucidar perto instantâneas concentrações do analito de interesse no fluido extracelular. Em breve (ver Robinson et al 4 para uma extensa revisão), um eletrodo é aplicado para levantar e abaixar a tensão de forma de onda triangular em um rápido tempo de escala4. Quando a tensão está no intervalo correto, o composto de interesse repetidamente é oxidado e reduzido. Esta oxidação e redução resulta em um movimento de elétrons que cria uma pequena corrente alternada. Varredura de taxas terá lugar na escala de subsegundos com oxidação e redução de compostos ocorrem em microssegundos. Subtraindo-se o plano de fundo atual criado pela sonda de corrente resultante, pode-se gerar uma tensão vs atual trama original para cada composto. Desde que a escala de tempo das oscilações da tensão é conhecida, esses dados podem ser usados para calcular uma parcela da corrente em função do tempo. Assim, a concentração relativa do composto pode ser determinada, enquanto o número de elétrons transferidos em cada oxidação e reação de redução é conhecida4.
Esta especificidade química e alta resolução temporal fazem FSCV uma técnica poderosa para a detecção de alteração química concentrações na vivo. No entanto, apesar dessas vantagens múltiplas, esta técnica requer vastos conhecimentos técnicos e equipamentos caros e instalação. Além disso, nonelectroactive neurotransmissores (e.g., glutamato) não podem ser medidos usando esta técnica. Felizmente, os avanços tecnológicos no campo da eletroquímica5, bem como a comercialização destas invenções, introduziu uma abordagem relativamente simples para medir os neurotransmissores não-eletroativos em animais comportamento acordados sem comprometer a técnica de precisão, um temporal conhecida como tecnologia biosensor enzimática. Esta técnica usa conversão enzimática do neurotransmissor nonelectroactive de interesse em dois substratos, um dos quais é eletroativos de peróxido de hidrogênio que é detectado como uma oxidação amperométrico atual gerada por um potencial aplicado5 . Biosensor comercialmente disponíveis sondas seletivamente (ver Figura 1) medem analitos de interesse, competitivamente, reduzindo a contribuição de interferentes endógenos. No caso de glutamato, a contribuição do ácido ascórbico interferent comuns (AA) é reduzida competitivamente à corrente medida pelo co localizando oxidase de AA na superfície do sensor, conversão de AA para não-eletroativos enzimática ativa dihydroascorbate e água. Além disso, uma camada de polímero Nafion carregada negativamente presente sob a camada de enzima exclui compostos aniônicos endógenos.
Esta mesma configuração experimental biosensor pode medir eletroativos neurotransmissores como FSCV, mas em vez disso, ele emprega um potencial fixo gravação6. Em contraste com a tensão oscilante aplicada em FSCV, na gravação de um potencial fixo a tensão é mantida no redox potencial para o analito de interesse. Embora seja menos quimicamente seletiva do que FSCV como vários neurotransmissores podem ter o mesmo potencial, de redox em áreas do cérebro que esmagadoramente inclinação para um neurotransmissor, a natureza da curva-chave desta abordagem supera a falta de química especificidade.
A capacidade de medir tanto eletroativos e nonelectroactive lançamento do neurotransmissor em tempo quase real e vinculá-lo a eventos comportamentais específicos fornece uma oportunidade para examinar a liberação de neurotransmissor convergentes. Este manuscrito detalha o uso deste sistema para interrogar a neurotransmissão tanto dopamina e glutamato em resposta a recompensa natural em hamsters comportamento acordados. O objetivo deste trabalho é a detalhar o processo de medição esta liberação de neurotransmissor durante o comportamento sexual em hamsters femininos, com o objetivo de demonstrar a sua viabilidade para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.
Os hamsters são um modelo ideal para uso em gravações de eletroquímicas
Historicamente, os modelos de ratos e camundongos têm sido empregados no estudo do comportamento sexual. Estas espécies de roedores se envolver em uma sequência de imperatividade dinâmica, envolvendo inúmeros comportamentos de solicitação feminino que incluem lupulagem, arremessam e orelha mexer para atrair o macho de perseguir e, finalmente, montar o feminino7. A montagem pelo macho (com ou sem penetração vaginal) dura apenas alguns segundos, durante o qual a fêmea se engaja na sua postura de comportamento sexual (denominada lordose) também só por alguns segundos antes de retomar comportamentos ativo solicitação. Este padrão de comportamento, composto por altos níveis de atividade intercalados com breves períodos de imobilidade, é problemático para medir a neurotransmissão em comportamento de animais. Primeiro, pode haver artefatos de movimento em amperométrico gravações que estão relacionadas com a atividade neural. Em segundo lugar, a locomoção é associada com a liberação de neurotransmissores particulares em certas regiões do cérebro. Por exemplo, liberação de dopamina tem sido acoplada a atividade locomotora do striatum dorsal e ventral8,9, uma descoberta que formou a base para medições microdialysis de dopamina após psicoestimulantes Administração10. Porque os comportamentos de solicitação fêmea-típico em mosroedores de t envolvem altos níveis de atividade locomotora e são representados pela maior parte de um teste de comportamento sexual de 10 minutos, isso dificulta a alterações na neurotransmissão, atribuímos aos componentes explícitos de comportamento sexual que coletivamente durar apenas minutos.
Para analisar o perfil neuroquímico do comportamento sexual feminino, este laboratório procurou uma espécie em que há atividade locomotora mínima que acompanha o comportamento sexual. A sequência copulador no hamster sírio (Mesocricetus auratus) é ideal para gravações neuroquímicas devido à falta de comportamentos de solicitação normalmente visto em ratos e camundongos11. Como consequência, os hamsters fêmeas entrará e manter a postura de lordose para mais de 9 minutos a 10 minutos de sessão12de teste. Com a falta de estranhos movimentos de locomoção pelo sexo feminino, na vivo gravações eletroquímicas que podem ser associadas a componentes de interações sexuais com o macho podem ser obtidas.
Copuladores lutas em hamsters
Após a introdução de um animal de estímulo masculino na câmara de teste, o macho irá inicialmente envolver anogenitais investigação (AI) da fêmea antes de montá-la (Figura 2). Em ordem para montar o macho, a fêmea deve assumir uma postura sexual receptiva, conhecida como lordose, no qual ela arcos de volta e desvia a cauda para que o macho de montagem pode ganhar acesso do pênis para a vagina dela. O macho vai montar a fêmea, abraçando seu traseiro com as duas patas (Figura 2B) e começar a empurrar na tentativa de ganhar penetração peniana (Figura 2C). O macho irá montar a fêmea (sem inserção), bem como intromit um número de vezes antes de finalmente conseguir a ejaculação. Esta sequência de montagens e intromissões levando a ejaculação é denominada um tal”imperatividade”. Os machos terá várias lutas copulativo dentro de uma única sessão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora relativamente simples, alguns problemas podem surgir quando empregando esta técnica. Em primeiro lugar, o posicionamento estereotáxica das sondas deve ser preciso: ao contrário do microdialysis que as amostras de um raio mais amplo do meio extracelular em torno da sonda, esta técnica só permite a medição de um neurotransmissor que entra em contato direto com a sonda. Em segundo lugar, no caso da gravação de fibra de carbono, devido a pequena largura da fibra, pode ocorrer a ruptura, e a sonda deve ser int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a graduação Daniel Korus por sua ajuda a executar o código Matlab e graduação Alex Boettcher por sua assistência na execução dos experimentos comportamentais. Este projeto é apoiado pela NSF IOS 1256799 de R.L.M e pelo Instituto Nacional sobre abuso de drogas do institutos nacionais da saúde sob prêmio número T32DA007234.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
