JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Tre-dimensionelle genopbygning af den vaskulære arkitektur i passiv klarhed-ryddet mus æggestokkene

Published: December 10, 2017
doi:
10.3791/56141
, , ,
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine,Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine,Stanford University

Summary

Her præsenterer vi en tilpasning af den passive klarhed og 3D rekonstruktion metoden for visualisering af æggestokkene kar og follikulært kapillærer i intakt mus æggestokke.

Abstract

Æggestokken er det vigtigste organ i den kvindelige reproduktive system og er afgørende for produktion af kvindelige mælke og til at kontrollere det endokrine system, men komplicerede strukturelle forhold og tredimensionale (3D) Vaskulaturen arkitekturer for den æggestokken er ikke godt beskrevet. For at visualisere 3D forbindelser og arkitektur af blodkar i intakt æggestokken, er det første vigtige skridt at gøre æggestokken optisk klar. For at undgå væv svind, brugte vi hydrogel fiksering-baserede passiv klarhed (Ryd Lipid-udvekslet acrylamid-hybridiseret stiv Imaging / immunfarvning/In situ-hybridisering-kompatibelt væv Hydrogel) protokol metode til at klare en intakt æggestok . Immunfarvning, avancerede multiphoton Konfokal mikroskopi og 3D billede-rekonstruktioner blev derefter brugt til visualisering af æggestokkene fartøjerne og follikulært kapillærer. Brug denne fremgangsmåde, vi viste en signifikant positiv sammenhæng (P < 0,01) mellem længden af follikulært kapillærer og volumen af follikulært væggen.

Introduction

Hårsækken er den grundlæggende strukturelle og funktionelle enhed i æggestokkene, og dens udvikling er stærkt relateret til Vaskulaturen i æggestokken. Blodkar levere ernæring og hormoner til folliklerne og således spille en vigtig rolle i vækst og modning af folliklerne1.

En kombination af teknologier, herunder selektiv blodkar markører, transgene musemodeller og farmaceutisk udvikling, har øget vores viden om æggestokkene vaskulære netværk, angiogenese og funktionen af blodkar i folliculogenesis. Æggestokken er kendt som en aktiv orgel, fordi det bygger om forskellige væv og vaskulære netværk under folliculogenesis og ægløsning. Sådanne aktive remodeling i størrelse og struktur af fartøjer, der er nødvendig for den biologiske funktion af udvikle og rekruttere follikler.

Traditionelle histologiske og histomorphometric metoder ved hjælp af æggestokkene sektioner og immunolabeling af blodkar er begrænset til todimensionale (2D) billeder2. Med udviklingen af tre-dimensionelle (3D) genopbygning teknologier, 2D-billeder af væv skiver kan skal overlappe hinanden for at gøre en 3D struktur, men denne metode stadig har nogle begrænsninger-skæring af væv kan ødelægge mikrostrukturer, nogle dele af den væv er ofte mangler, og betydelig arbejdskraft er involveret i at gøre 3D rekonstruktioner fra billeder fås fra skiver. Hele-væv 3D imaging med Konfokal mikroskopi kan løse mange af disse begrænsninger, men disse metoder er begrænset til evaluering af angiogenese i embryonale æggestokken3. Ved hjælp af hele væv clearing metoder såsom klarhed4 kan øge den visualiseret volumen for at løse disse problemer i postnatal og voksen æggestokke, og sådanne metoder giver optisk clearance af æggestokken uden nogen strukturelle deformationer. Billeddannelse af intakt æggestokken 3D arkitektur giver en nøjagtig billeddatabase efter billede analyse software, som den Imaris softwarepakke anvendt i dette arbejde.

Ombygning af æggestokken gennem voksenalderen er en del af en dynamisk fysiologiske system, og det gør æggestokken en fremragende model for efterforskning af reguleringen af angiogenese. Desuden kan evaluering af æggestokkene blodkar rolle i patologiske betingelser for den kvindelige reproduktive system såsom polycystisk ovariesyndrom og æggestokkene kræftformer studeres gennem hele æggestokkene væv billeddannelse. Udviklingen af metoden passiv klarhed og anvendelse af avancerede billede analyse software har givet detaljerede geografiske oplysninger om relationer mellem blodkarrene og æggestokkene strukturer, såsom hårsække.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr fag fulgt retningslinjerne i den animalsk etiske komité på Shanghai Medical College, Fudan University (godkendelsesnummer 20160225-013). 1. forberedelse af gennemsigtige mus æggestok Forberedelse af løsninger Forberede fosfatbufferet saltopløsning (PBS) opløsning (1 M, pH 7,6) med 0,1% Triton X-100 (PBST). For at gøre 1 liter 10 x PBS stamopløsning, mix 87 g NaCl, 3.1 g NaH2PO4 · 2H2</…

Representative Results

Vi tilpasset metoden passiv klarhed i en hurtig og enkel metode til passiv æggestokken clearing samtidig bevare den follikulære og vaskulære arkitektur og opnå den højeste fluorescerende signal fra mærket markører af fartøjer og follikler. Follikulært Vaskulaturen 3D arkitektur blev fastsat ved immunfarvning for CD31, en markør i endothelial celler6. CD31 farvning i æggestokkene af voksen mus var spores ved hjælp af glødetrådens algoritme og viste ind…

Discussion

I den aktuelle undersøgelse præsenterer vi 3D imaging for at vurdere forholdet mellem kapillærer og individuelle voksende follikler. I vores tidligere arbejde ved hjælp af den samme protokol 9, studerede vi roller i store kar, interaktioner mellem follikler, og placeringen af follikler i intakt mus æggestokkene. KLARHED passivitet tillod os at studere mikro – og makro-vasculatures, folliculogenesis og indbyrdes forhold mellem corpora lutea og follikler samt at rekonstruere den æggestokkene a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den kinesiske særlig fond for Postdocs (nr. 2014T70392 til YF), den National Natural Science Foundation of China (nr. 81673766 til YF), den nye lærer Priming fond, Fudan University Zuoxue grundlæggelse og udvikling Projekt af Shanghai Peak discipliner-Integrativ medicin (20150407).

Materials

Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Tags

3D ReconstructionVascular ArchitectureCLARITY-clearedMouse OvaryFollicle DevelopmentSomatic CellsVascular SystemNervous SystemPassive CLARITYImage AnalysisImarisPerfusionHydrogelOvarian Bursa
check_url/56141?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image