Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.
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Artigo de método
Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.
Introdução
Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mai....
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Protocolo
Nota: as seguintes etapas de amplificação e método de extração são amplamente generalizáveis para muitos do fago de DNA dupla-hélice, por exemplo, do bacteriófago T7, enterobactérias do fago T4 ou enterobactérias do fago λ (L). Eles são predominantemente utilizados para um phage cujo genoma não está prontamente disponível para a compra de fontes comerciais.
1. amplificação do fago
Nota: A único-placa, ciclo multi fago (SPMC) produção técnica é bem descrita para o phage T4 em Chen, et al 14 a seguir amplificação do fago e DNA método de extração é uma generalização para u....
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Resultados
Vamos mostrar quatro resultados representativos. Na Figura 1, apresentamos um conjunto de controles negativos para garantir que o sistema TXTL livre de célula e as existências de ADN do fago não estão contaminadas com vivos células de Escherichia coli . Verificamos que o sistema TXTL sem célula é livre de intacto Escherichia coli célula contaminação por chapeamento uma solução não incubados e incubadas reação vazio de DNA genômico (
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Discussão
Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alcançará crescimento l.......
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Divulgações
Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: laboratório de Noireaux recebe fundos de pesquisa do MYcroarray, um distribuidor do kit de expressão da proteína sem célula de MYtxtl.
Agradecimentos
Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de ultracentrifugação | Beckman Coulter | 344057 | |
| Tubos cônicos | Falcon | 352070 | |
| Fabricante de gradientes | BioComp Gradient Master | ver Anal Biochem. 1985 julho; 148(1):254-9. | |
| Seringa e Cânula Romba | Monoject | 8881513918 e 888202017 | |
| Pontas de pipeta de diâmetro largo | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Contador de placas | New Brunswik Scientific | Colony Counter Modelo C-110 | |
| Tubos de cultura | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Sistema sem células | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Modelo 105ME | |
| LB receita de placa de | 25 g/L de meio Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents número do produto BP1426) e 15 g/L de Bacto-Agar sólido (Brenton, Dickenson and Company - número do produto 214010). |
Referências
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V.
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Reimpressões e permissões
