Denne protokollen beskriver en klinisk-aktuelt måte oppløsende hydrofobe forbindelser i en vandig miljø med kombinasjoner av selvstendig montering peptid og aminosyre løsninger. Vår metode løser en stor begrensning av hydrofobe therapeutics, mangler, effektive middel til løselighet og levering i klinisk innstillinger.
Selv av peptider (tjenestetilgang) er lovende biler for levering av hydrofobe therapeutics for klinisk bruk; amphipathic egenskaper tillate dem å oppløse hydrofobe forbindelser i vandig miljøet i menneskekroppen. Men selv montasje peptid løsninger har fattig blod kompatibilitet (f.eks, lav osmolaritet) hindre deres klinisk anvendelse gjennom intravenøs administrasjoner. Vi har nylig utviklet en generalisert plattform for hydrofobe narkotika-leveranser, som kombinerer safter aminosyre løsninger (SAP-AA) for å forbedre narkotika løselighet og øke formulering osmolaritet å nå kravene for klinisk bruk. Denne formuleringen strategien ble grundig testet i forbindelse med tre strukturelt forskjellige hydrofobe forbindelser-PP2, rottlerin og curcumin-for å demonstrere sin allsidighet. Videre undersøkte vi effekten av skiftende formulering komponenter ved å analysere 6 forskjellige safter, 20 naturlig eksisterende aminosyrer i lave og høye konsentrasjoner, og to forskjellige co løsemidler dimethyl sulfoxide (DMSO) og etanol. Vår strategi viste seg for å være effektive i å optimalisere en gitt hydrofobe narkotika og terapeutisk funksjon av den formulerte inhibitor, PP2, ble observert både i vitro og i vivo. Dette manuskriptet skisserer våre generalisert formulering metoden ved hjelp av SAP-AA kombinasjoner for hydrofobe forbindelser og analyse av løselighet som et første skritt mot potensielle bruk av disse formuleringene i mer funksjonelle studier. Vi inkluderer representant løselighet resultater for utformingen av den hydrofobe sammensatte, curcumin, og diskutere hvordan vår metode fungerer som en plattform for fremtidige biologiske studier og sykdom modeller.
Saper er en klasse av biologisk materiale som har blitt studert grundig som 3D stillaser i regenerativ medisin1,2,3,4. Flere nylig imidlertid har de blitt utnyttet som kjøretøy for leveranse av therapeutics på grunn av sin unike biologiske egenskaper5,6,7,8. Saper naturlig samle inn stabil nanostrukturer9, gir et middel for narkotika innkapsling og beskyttelse. Saper er amphipathic, består av et bestemt mønster av hydrofobe og hydrofile aminosyre gjentas, kjøre deres selvtillit forsamlingen9,10 og tillater dem å tjene som et medium mellom hydrofobe og hydrofile miljøer. Derfor for klinisk levering av hydrofobe narkotika-som har ekstremt lav bioavailability og absorpsjon i kroppen på grunn av løselighet i vandig miljøer11,12 -SAPer er lovende som en levering kjøretøy. Videre innebærer sine sekvens mønster også at safter kan rasjonelt designet og konstruert for å maksimere kompatibilitet med alle gitt narkotika eller sammensatte (dvs., basert på funksjonelle grupper) og videre hjelpe oppløselighet.
Saper er brukt som effektive levering biler i mange i vitro og vivo innstillinger13,14,15,16. De har også vist stor sikkerhet og biocompatibility. Men på grunn av lav osmolaritet SAP-stoff forberedelser, kan ikke de brukes for intravenøs injeksjoner som klinisk innstillinger13. Vurderer denne tvang, vi har nylig utviklet en strategi som kombinerer safter aminosyre løsninger for å redusere bruken av giftige co løsemidler og øke formulering osmolaritet, og derfor kliniske relevans. Vi valgte å bruke aminosyrer som de er byggesteinene i safter, er allerede klinisk akseptert, og i kombinasjon med safter, de øker hydrofobe narkotika løselighet mens redusere SAP kreves17,18.
Vi har gransket SAP-AA kombinasjoner som en generalisert plattform for hydrofobe narkotika løselighet og senere levering ved å opprette en flertrinns screening rørledning og bruke det på den Src inhibitor, PP2, som en modell hydrofobe compound. I denne prosessen undersøkte vi effekten av skiftende komponenter av utformingen-slutt testing 6 forskjellige safter, alle 20 aminosyrer i 2 ulike konsentrasjoner (lav og høy, lav basert på konsentrasjoner i eksisterende klinisk bruk, og høy konsentrasjoner var 2 x, 3 x eller 5 x klinisk konsentrasjonen basert på maksimal Løseligheten av hver aminosyre i vann), og 2 forskjellige co løsemidler – og utvalgte kombinasjoner som solubilized PP2 for videre analyse. Denne drug formulering viste seg for å være effektiv som et stoffet levering kjøretøy i cellekultur, samt i vivo modeller med både intratracheal og intravenøs administrasjoner. Likeledes, arbeidet rørt på allsidigheten av SAP-AA kombinasjoner i solubilizing flere strukturelt-ulike hydrofobe forbindelser i vandig miljøer. spesielt narkotika rottlerin og curcumin18. Dette manuskriptet skisserer SAP-AA formulering metoden og analyse av curcumin løselighet som et eksempel på det viktigste trinnet i våre screening rørledningen. Denne protokollen gir optimal SAP-AA kombinasjonene, som oppløse alle gitt hydrofobe sammensatte reproduserbar enkelt til skjermen.
I formulering prosedyren er det ulike avgjørende skritt og punkter for å vurdere i feilsøking. Først, som vi arbeider med ulike komponenter og konsentrasjoner, flere vortex trinn gjennom protokollen sikrer at alle konsentrasjoner er uniform og korrekt. Noen av høy-konsentrasjon, hydrofobe aminosyre løsningene fortsatt helt oppløses ikke etter vortexing, og i dette tilfellet kan de rokkes kraftig av assisterer i prosessen. Likeledes er det viktig at SAP-AA løsninger gjennomgå sonication trinnet skissert i trinn 2…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av kanadiske institutter for helseforskning, gir drift MOPP-42546 og MOPP-119514.
EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |