Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza
Summary
Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.
Abstract
Enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) O157: H7, che è un agente patogeno portato dagli alimenti che causesdiarrhea, colite emorragica (HS), e la sindrome uremica emolitica (HUS), colonizzare il tratto intestinale degli esseri umani. Per studiare il meccanismo dettagliato della EHEC colonizzazione in vivo, è essenziale disporre di modelli animali per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC. Dimostriamo qui un modello di colonizzazione del mouse-EHEC trasformando il plasmide di espressione bioluminescente per EHEC per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC in soggiorno ospiti. Animali inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC mostrano segnali bioluminescenti intensi in topi tramite rilevazione con un non-invasiva in vivo imaging sistema. Dopo 1 e 2 giorni dopo l’infezione, bioluminescenti segnali potrebbero essere ancora presente in animali infettati, che suggerisce che EHEC colonizzare in padroni di casa per almeno 2 giorni. Inoltre dimostriamo che questi EHEC bioluminescenti individuare all’intestino del mouse, specificamente nell’intestino cieco e del colon, da immagini di ex vivo . Questo modello di colonizzazione del mouse-EHEC può servire come strumento per far progredire la conoscenza corrente del meccanismo di colonizzazione di EHEC.
Introduction
EHEC O157: H7 è un patogeno che causa diarrea1, HS2, HUS3e anche insufficienza renale4 attraverso cibo o acqua contaminato. EHEC è un patogeno enterobacterium e colonizza il tratto gastrointestinale di esseri umani1. Quando EHEC prima aderire all’epitelio intestinale host, iniettano i fattori di colonizzazione nelle cellule ospiti attraverso il sistema di secrezione di III tipo (T3SS) che funziona come una siringa molecolare che induce un fissaggio e cancellando (A/E) lesione successivamente per imporre adesione (colonizzazione)5. Questi geni coinvolti nella formazione della lesione A/E codificati per il locus dell’enterocita (LEE) il effacement patogenicità isola5.
Bioluminescenza è una reazione chimica produzione di luce, in cui luciferasi catalizza la luciferina di substrato per generare luce visibile6. Questo processo enzimatico richiede spesso la presenza di ossigeno o l’adenosina trifosfato (ATP)6. Bioluminescenza imaging (BLI) permette ai ricercatori la visualizzazione e la quantizzazione delle interazioni ospite-patogeno in animali vivi7. BLI possono caratterizzare il ciclo di infezione batterica in animali vivi seguendo i batteri bioluminescenti come migrare e invadere i tessuti differenti7; Questo rivela una progressione dinamica dell’infezione. Inoltre, la carica batterica negli animali è relativo al segnale bioluminescenti8; così, è un comodo indicatore per stimare le condizioni patologiche degli animali da esperimento in modo semplice e diretto.
Il plasmide usato qui contenute l’operone luciferasi, luxCDABE, che è il batterio Photorhabdus luminescens che codifica la propria luciferasi substrato7,9. Trasformando questo plasmide esprimendo la luciferasi in batteri, i processi di colonizzazione e l’infezione possono essere monitorati osservando questi batteri bioluminescenti animali vivi. Nel complesso, BLI e bioluminescenza-identificati batteri permettono ai ricercatori di monitorare i numeri batterici e la posizione, la vitalità batterica con antibiotici/terapia trattamento ed espressione genica batterica infezione/colonizzazione6, 7. sono stati segnalati numerosi batteri patogeni che esprimono l’operone luxCDABE per esaminare la loro espressione di ciclo e/o gene di infezione nell’infezione. Questi batteri, tra cui uropathogenic Escherichia coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogeni e. coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, sono stati documentati.
Parecchi modelli sperimentali sono stati sviluppati per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione in vitro e in vivo21,22,23. Tuttavia, c’è una mancanza di adeguati modelli animali per studiare l’EHEC colonizzazione in vivoe quindi una conseguente scarsità di dettagli. Per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione meccanismo in vivo, è prezioso per costruire modelli animali per osservare e quantificare la colonizzazione di EHEC animali vivi in un metodo non-invasivo.
Questo manoscritto descrive un modello di colonizzazione del mouse-EHEC che utilizza un sistema di espressione bioluminescente per monitorare la colonizzazione di EHEC nel tempo in soggiorno ospiti. Topi intragastrically vengono inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC e viene rilevato il segnale bioluminescente in topi con un non-invasiva in vivo imaging sistema13. I topi infettati con bioluminescenza-labeled EHEC hanno mostrato significativi segnali bioluminescenti in loro intestino dopo 2 giorni dopo l’infezione, che ha suggerito che tali batteri colonizzarono nell’intestino ospite dopo 2 giorni dopo l’infezione. Ex vivo immagine dati hanno mostrato che questa colonizzazione è specificamente nell’intestino cieco e del colon dei topi. Utilizzando questo modello di mouse-EHEC, la colonizzazione di EHEC bioluminescente può essere rilevata nell’ospite vivente da uno in vivo imaging system, per studiare i meccanismi dettagliati della colonizzazione di batteri enterici, che possono promuovere ulteriore comprensione in Cambiamenti fisiologici e patologici indotti da EHEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato segnalato che EHEC trasformati con il plasmide luciferasi è stato utilizzato per esaminare la localizzazione nel host o espressione genica in vivo8,11,12. Il modello murino dimostrato qui è stato segnalato anche per rilevare i tempi di EHEC colonizzato e localizzazione in host murino8. Tuttavia, forniamo il protocollo di dettaglio di come amministrare l’inoculazione di EHEC ai topi int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo Chi-Chung Chen dal dipartimento di ricerca medica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) per l’aiuto nel topo di infezione e il supporto dal centro laboratorio animale della National Cheng Kung University. Questo lavoro è sostenuto dal Ministro della scienza e tecnologia (MOST) concede (più 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) a CC.
Materials
| Shaker incubator | YIH DER | LM-570R | bacteria incubation |
| Orbital shaking incubator | FIRSTEK | S300 | bacteria incubation |
| pBSL180 | source of nptII gene | ||
| pAKlux2 | source of luxCDABE operon | ||
| T&A Cloning Kit | Yeastern Biotech | FYC001-20P | use for TA cloning |
| Nsi I | NEB | R0127S | use for plasmid cloning |
| Sca I | NEB | R0122S | use for plasmid cloning |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | use for plasmid cloning |
| Sma I | NEB | R0141S | use for plasmid cloning |
| T4 ligase | NEB | M0202S | use for plasmid cloning |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| dNTP Mixture | TaKaRa | RR001A | use for PCR amplification |
| PCR machine | applied Biosystem | 2720 thermal cycler | for PCR amplification |
| Glycerol | SIGMA | G5516-1L | use for bacteria stocking solution |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | chemical for making LB medium, 10 g/L |
| Yeast Extract powder | Affymetrix | 23547-1 KG | chemical for making LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | chemical for making LB agar |
| kanamycin | Sigma | K4000-5G | antibiotics, use for seleciton |
| streptomycin | Sigma | S6501-100G | antibiotics, eliminate the microbiota in mice |
| EDL933 competent cell | Homemade | method is on supplemental document | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | use for centrifuging bacteria |
| Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | JLA10.5 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Beckman Coulter | REF357003 | use for centrifuging bacteria |
| centrifuge bottles | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | use for centrifuging bacteria |
| eppendorf biophotometer plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | for measuring the OD600 value of bacteria |
| C57BL/6 mice | Laboratory Animal Center of NCKU | ||
| lab coat, gloves | for personnel protection | ||
| isoflurane | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | for mice anesthesia, pharmaceutical grade |
| 1ml syringe | use for oral gavage of mice | ||
| Reusable 22 G ball-tipped feeding needle | φ0.9 mm X L 50 mm | use for oral gavage of mice | |
| surgical scissors | use for mice experiment | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS spectrum | use for bioluminescent image capture |
| Living Image Software | Perkin Elmer | version 4.1 | use for quantifying the image data |
References
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
- Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
- Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
- Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. . Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
- Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).
- Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
- Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
- Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
- Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
- Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
- Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
- Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).
- Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).
- Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
- Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud’homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
- Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
- Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
- Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
- Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
- Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).
