Denne protokol beskriver dissektion og immunfarvning af voksen Drosophila melanogaster hjernen væv. Specifikt, fremhæver denne protokol brugen af Drosophila champignon krop og fotoreceptor neuroner som eksempel neuronal delmængder, der præcist kan bruges til at afdække generelle principper ligger til grund for mange aspekter af neuronal udvikling.
Nervesystemet udvikling indebærer en Sekventiel serie af begivenheder, der koordineres af flere signaling veje og regulerende net. Mange af de proteiner involveret i disse veje er evolutionært bevaret mellem pattedyr og andre eukaryoter, såsom bananfluen Drosophila melanogaster, tyder på, at lignende organisering principper findes under udviklingen af disse organismer. Vigtigere, har Drosophila været udbredt at identificere cellulære og molekylære mekanismer regulere processer, der kræves i pattedyr, herunder neurogenese, differentiering, cytoskeletale vejledning og synaptogenesis. Fluer har også været anvendt med succes til at modellere en række menneskelige udviklingsforstyrrelser sygdomme. Her beskriver vi en protokol for en trinvis microdissection, fiksering og immunfluorescent lokalisering af proteiner i voksen Drosophila hjernen. Denne protokol fokuserer på to eksempel neuronal populationer, champignon krop neuroner og retinal fotoreceptorer, og indeholder valgfrie trin for at spore individuelle champignon krop neuroner ved hjælp af Mosaic analyse med en teknik, Repressible celle markør (MARCM). Eksempeldata fra både vildtype og mutant hjerner er vist sammen med en kort beskrivelse af en scoring kriterier for cytoskeletale vejledning defekter. Mens denne protokol fremhæver to veletablerede antistoffer for at undersøge morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner, andre Drosophila hjerneregioner og lokalisering af proteiner inden for andre områder af hjernen kan også være undersøgt ved hjælp af denne protokol.
Selvom Drosophila nervesystemet er mindre end mennesker og gnavere, giver dens kompleksitet en kraftfuld, imødekommende model for bedre at forstå dens hvirveldyr modparter. I mange tilfælde indkode genomer af hvirveldyr og fluer meget lignende proteiner, der dikterer mekanismerne af nervesystemet udvikling. I virkeligheden, kræves mange af generne, der for neuronal udvikling i hvirveldyr har orthologs i fluer, herunder dem, der er involveret i signaling veje at kontrol mønstre, neurogenese og cytoskeletale vejledning1,2,3 ,4,5. For eksempel, er netrin en ligand kræves cytoskeletale vejledning i pattedyr og D. melanogaster6,7,8. Mens netrin blev oprindeligt isoleret fra embryonale chick hjernen væv6, har efterfølgende undersøgelser vist, at netrin spiller en bevaret rolle under udviklingen af embryonale centralnervesystemet (CNS) i Drosophila8. Andre undersøgelser har brugt genetiske skærme i den embryonale Drosophila CNS til at identificere bevarede ligander og receptorer kræves for pathfinding i både Drosophila og hvirveldyr9.
Mens den embryonale flyve CNS har været udbredt i fortiden for at identificere ligander, receptorer og intracellulær signalering proteiner kræves for cytoskeletale vejledning8,9, har seneste arbejde undersøgt måder, som mange af disse proteiner også styre pathfinding beslutninger under senere stadier af udvikling. Specielt, har undersøgelsen af champignon krop (MB) og retinal fotoreceptor neuron udvikling (figur 1) givet indblik i mekanismerne at kontrol pathfinding, synapse dannelse, axon beskæring og flere andre aspekter af neuronal udvikling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuroner tilsluttes regioner i den voksne hjerne kaldet lamina flyve nethinden og medulla og er kritisk for genudlægning visuel information til hjernen (anmeldt af18,19), mens champignon krop neuroner er centralt beliggende i flyve hjernen og er nødvendig for indlæring og hukommelse20,21. Både fotoreceptor neuroner og de iboende neuroner champignon organer, kaldet Kenyon celler, udnytte evolutionært bevarede diffusible og kontakt-afhængige cytoskeletale vejledning mekanismer for at finde deres post synaptic mål. Ud over at være synlig i voksne fluer, kan fotoreceptor og MB neuroner også direkte visualiseres i larver og pupper med antistoffer eller reporter gener22,23,24,25. Mulighed for at nemt visualisere disse to sæt af neuroner på forskellige udviklingsmæssige tiden point har fremmet deres brug som fantastiske modeller for mange aspekter af neuronal udvikling.
Ud over bliver brugt som en model til at forstå mekanismerne af normale nervesystem udvikling, har de seneste undersøgelser vist, at fluer kan også fungere som nøjagtige modeller af en bred vifte af sygdomme hos mennesker, herunder skrøbelige X syndrom (FXS)26 , Intellektuelle handicap (ID)27,28,29,30,31, og andre32. For eksempel, for at studere den molekylære funktion af ZC3H14, et gen for nylig forbundet med menneskets intellektuelle handicap, vi skabt en flyve model af ID’ET ved hjælp af en null allel af flue ZC3H14 ortholog, kaldet Nab230. Fluer mangler Nab2 har alvorlige hukommelse funktionshæmninger og udvidet poly(A) haler, recapitulating hvad er observeret i menneskelige patienter eller patienten afledt celle linjer33,34. Vigtigere, vise fluer mangler Nab2 også alvorlige hjerne morfologi defekter i deres voksne champignon organer34, svarende til hvad er observeret i fluer mangler FXS syndrom gen, FMR135. Således kan fluer tjene som en vigtig model organisme at studere både normal hjernens udvikling og sygdomme, der forstyrrer det.
Endelig, tilgængelighed af høj overførselshastighed metoder til at overvåge adfærd, kombineret med det enorme opbud af tilgængelige genetiske værktøjer, gøre Drosophila en model organisme valg for at identificere de områder af hjernen, der styre komplekse opførsel, som indlæring og hukommelse, søvn, frieri, tørst og andre36,37,38,39. En særlig nyttigt værktøj, der er på midten af en flyve genetiker “værktøjskasse” er GAL4/UAS system (figur 2). Dette system40,41 bruger væv specifikt udtryk for Gal4 transcriptional aktivator for at øge udtryk af gener eller transgener nedstrøms af en Upstream aktivering sekvens (UAS). Ændringer af dette system har tilladt forskere at, for eksempel, netop kontrol ophidselse af specifikke neuroner42,43, overexpress eller knock-down specifikke gener af interesse44, 45, analysere real-time calcium dynamics i vivo46, og express reporter gener til at markere neuronal lineages41. Kombinationen af GAL4/UAS system med mitotiske rekombination også tilladt for oprettelsen af mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) system12,47. MARCM har været udbredt i enkelt neuron sporing til at identificere de cellulær signalering komponenter, der kræves for cytoskeletale vejledning12,47. Selv om disse og andre teknikker har givet en række værdifulde indsigter om de cellulære mekanismer, der kræves for nervesystemet funktion, kræver de fleste at Drosophila -hjernen først blive dissekeret; omhyggelig fjernelse af hjernen er forpligtet til at opretholde korrekte hjernens morfologi og forbindelsen mønstre mellem hjerneregioner. Følgende protokol bruger champignon krop og fotoreceptor neuroner someksempel neuronal befolkninger som det guider dig gennem dissektion og immunfluorescent farvning af voksen Drosophila brains.
Den ovenfor beskrevne dissektion og visualisering metode kan anvendes i en bred vifte af immunfarvning og live billedbehandlingsprogrammer. Vi har skitseret en generel immunfarvning protokol og har understreget én måde, hvorpå MARCM kan bruges til at visualisere cytoskeletale morfologi af individuelle champignon krop neuroner. Derudover disse generelle procedurer kan også bruges til imaging andre områder af hjernen i fast eller frisk dissekeret voksen hjerne48,65. Live imaging kan yde en mere effektiv tilgang når analysere udtryk mønstre forstærker fælder, reporter gener eller efterligne linjer66, f.eks. At forhindre fanger artefakter fra celledød under live imaging af normal god landbrugspraksis i ikke optagne væv, hjerne bør være dissekeret i 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) eller HL3 media48, monteret på broen dias i 1 x PBS (eller HL3) og afbildet i mindre end 15-20 min. pleje bør også tages til at fjerne så meget luft som muligt fra dissekeret hjernen før billedbehandling, da det kan forstyrre visualisering af normal god landbrugspraksis fluorescens.
Mens farvning betingelserne for at vurdere morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner er forholdsvis veletableret24,61,67, lokalisering af et specifikt protein af interesse i disse celle typer kan kræve omfattende fejlfinding og optimering. Navnlig skal flere kritiske trin, herunder antistof fortynding, blokerende buffer komponent koncentration og fiksering, optimeres for at generere de mest reproducerbare og pålidelige resultater. Først, den optimale koncentration af primære antistof bør fastlægges. Selv om kommercielt tilgængelige antistoffer ofte har en foreslået fortynding (og vi ofte først starte ved hjælp af denne koncentration), er disse værdier sjældent bestemt empirisk på Drosophila væv. Derfor tester en serie af primære antistof fortyndinger, der spænder over og under fabrikantens start forslag ofte resulterer i mere specifik farvning. Mens primære antistof fortynding kan have en betydelig indvirkning på farvning nøjagtighed og præcist fastsættes, tid hjerner er udruget i primære antistof der indeholder kan løsninger variere betydeligt med lille effekt på det samlede resultat. For eksempel, har vi observeret lignende resultater når inkubere dissekeret hjerner med Fas2 antistof primære antistof for to, tre eller endda fire dage ved 4 ° C. Selv om vi anbefaler mindst to nætter, har vi også inkuberes hjerner i primære antistof løsning for en enkelt nat og opnået reproducerbare farvning. Vigtigere, hjælper begrænser mængden tid hjerner er udruget i den sekundære antistof til 3 timer ved stuetemperatur (eller en nat ved 4 ° C) grænse ikke-specifik binding af sekundære antistoffer til hjernevæv.
Andet, kan det være nødvendigt at bruge yderligere “blokering” reagenser til at fjerne uønsket baggrund signal. Indstillinger omfatter øget koncentration af NGS ~ 10%, tilføje 1-10% bovint serumalbumin (BSA) til blokering og primær/sekundær antistof løsninger, eller før adsorption af primære antistoffer natten over ved 4 ° C med Drosophila embryoner (Se reference68, afsnit 2.9, trin 3).
Mens vi har skrevet ovenstående protokollen bruger PTN som den foreslåede buffer for alle fiksering, kan vask, og antistof inkubation trin, væv fiksering i andre buffere (såsom PLP og PEM, der er opført i Materialer tabel) resultere i dybe forskelle i signalstyrke. For eksempel, har tidligere undersøgelser vist at Cyclin E er ikke målbart i larve fantasiens diske når væv er fast i traditionelle 4% PARAFORMALDEHYD fortyndes i PBS, men er klart synlig, når væv er faste i PLP buffer (Ken Moberg, personlige kommunikation og reference69). Ud over ændringer i buffer komponenter, ændre tid og temperatur til vævet fiksering kan også væsentligt påvirke immunfluorescent farvning og empirisk kan bestemmes, hvis det er nødvendigt. Generelt, fiksering tid skal være lang nok til at give mulighed for tilstrækkelig crosslinking af cellulære komponenter og langsigtede vedligeholdelse af samlede cellulære morfologi samtidig være begrænset nok til at forhindre over-crosslinking og “begrave” af protein epitoper. Derfor, når i første omgang optimere farvning betingelser for en nyerhvervede primære antistof, vi normalt begrænse fiksering tid til ca 20 min og vil ofte løse væv på koldere temperaturer.
Flere kontrolelementer bør indgå i enhver immunofluorescens eksperiment for at undersøge specificiteten af primære og sekundære antistoffer samt effekten af transgener/genetiske baggrund på de observerede fænotype. For at fastslå, om den primære antistof anvendes specifikt genkender protein af interesse, skal væv fra fluer mangler dette protein og/eller væv overekspression af protein medtages som kontrol. Tilsætning af overskydende renset antigen protein kan også indgå for at afgøre, om den primære antistof genkender andre epitoper i flyve hjernen. Endelig repræsenterer nogen fluorescerende signal når primære antistoffer er udeladt niveauet af ikke-specifik binding af de udvalgte sekundære antistoffer.
Flere vigtige kontrol bør inddrages for at vurdere bidrag af genetiske baggrund eller tilstedeværelsen af transgener til farvning intensitet eller neuronal morfologi. For eksempel fluerne bruges i MARCM forsøget i figur 5 indeholder flere transgener (hsFLP, UAS-CD8-normal god landbrugspraksis, FRT82B, badekar > GAL80, og OK107-GAL4), hvoraf hver bør analyseres separat for effekter på champignon krop morfologi. På et absolut minimum, champignon krop morfologi af fluer bør som indeholder både OK107-GAL4 og UAS-CD8-normal god landbrugspraksis være analyseret. Det kan også være nødvendigt at vurdere effekten af heat shock og Flp recombinase produktion på champignon organ udvikling ved at analysere fluer som indeholder både hsFLP og FRT82B. Selv om MARCM kan give betydelig indsigt i hvorvidt en given protein selvstændigt styrer cytoskeletale vejledning, kan antallet af Kontroller præcist foretage denne konklusion være en mindre begrænsning af denne teknik. Der gælder også ens kontrolelementer i mindre kompliceret eksperimenter. For eksempel, tage et eksperiment, hvor GAL4/UAS system bruges i kombination med et RNAi transgen til knockdown udtryk for et protein af interesse for alle neuroner. I dette eksperiment, mindst to transgener vil være til stede: en pan-neuronal GAL4 driver, såsom elav-GAL4, og UAS-RNAi transgenet. Morfologi af champignon krop neuroner i fluer der indeholder hver af disse transgener alene bør undersøges ud over den eksperimentelle tilstand hvor fluer harbor begge transgener i den samme flyve.
Endelig for at afgøre, om protein af interesse er udtrykt i champignon krop neuroner er det normalt nødvendigt at co pletten hjerner med antistoffer til Fas2. Fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis, RFP eller membranen bundet CD8-normal god landbrugspraksis kan alternativt også udtrykkes ved hjælp af GAL4/UAS system og bruges i kombination med antistoffer anerkende protein af interesse. Da Fas2 kun anerkender fasciculated axoner, der danner champignon krop α og β lapper, har brug af GAL4-drevet, membran-bundet CD8-NGL været særlig nyttig for mærkning champignon krop neuroner.
Defekter i cytoskeletale vejledning er ofte ikke 100% penetrant og endda hjerner af den samme genotype kan vise nogle variation. Derfor, når analysere nyligt genererede mutante alleler for defekter i champignon krop eller fotoreceptor pathfinding, en kombination af forskellige alleler og tilgange bør udnyttes. De fleste undersøgelser i litteraturen bruge flere forskellige tilgange til at undersøge, om et protein spiller en celle-selvstændig rolle i at kontrollere cytoskeletale vejledning: Jeg) analyse af pathfinding defekter i homozygot null fluer (helst med forskellige null alleler), ii) analyse af pathfinding defekter i fluer mangler protein af interesse kun i neuroner (normalt via RNAi), iii) MARCM analyse af pathfinding defekter, og iv) redde eksperimenter hvor genet er re udtrykt i neuroner i homozygot null fluer. Ideelt set, flere dusin hjerner pr. genotype bør analyseres for defekter i neuronal morfologi.
Selv om protokollen beskrevet her primært fokuserer på immunfluorescent lokalisering af proteiner i faste væv, udvikles flere fremtidige anvendelser af denne teknik til billede live hjernevæv. Når hjerner er dissekeret (normalt i celle kultur medier), kan de så være kulturperler i flere dage ved 25 ° C. Disse ex vivo dyrkningsbaserede metoder er ved at blive udviklet for at undersøge en bred vifte af biologiske processer, såsom protein aktivitet, der fremmer axon regeneration efter skade70,71, intracellulære Signaling dynamics72, og neuronal udvikling73.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Changhui Pak og Olafs Vrailas Mortimer for i første omgang undervisning SMK hjernen dissektion teknik. Vi takker også medlemmerne af Ken Moberg lab gruppe, især Chris runder, for kritisk læsning af manuskript. Antistoffer anerkende Fas2 (1 d 4) og chaoptin (24B10) stammer fra den udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank. Antistof 24B10 blev indsat på DSHB af Seymour Benzer og Nansi Colley24,60,61, antistof 1 d 4 blev indsat på DSHB af Corey Goodman 22,23,56. Flyve bestande blev indhentet fra Bloomington Stock Center. Vi ønsker også at takke Ohio landbrugsforskning og udvikling Center (OARDC) MCIC Imaging Center for brug af en Konfokal mikroskop billede hjerner i figur 4A og B. SMK understøttes af et tilskud fra NICHD (1 R15 HD084241-01A1).
Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potential Fixation Buffers | |||
PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly Stocks available from Bloomington | |||
elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |