本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库构建方案，用于从稀有鸡胚样本中生成全基因组表观基因组谱图。
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本文内容
摘要
摘要
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛应用的技术，用于绘制翻译后修饰组蛋白、组蛋白变体、转录因子或染色质修饰酶在特定基因座或全基因组范围内的定位。将ChIP实验与下一代测序（next-generation sequencing, NGS）相结合，即， 染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）是一种强大的方法，可用于全局揭示基因调控网络，并改进基因组的功能注释，尤其是非编码调控序列的功能注释。常规的ChIP实验方案通常需要大量细胞材料，因而限制了该方法在稀有细胞类型或小型组织活检样本中的应用。为了使ChIP实验能够适用于通常可获取的生物样本量 体内 在早期脊椎动物胚胎发育过程中，本文介绍了一种简化的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案，通过减少完成检测所需的步骤，以最大限度降低样品损失。该ChIP方案已成功应用于多种鸡胚胎及成年小鼠组织中不同组蛋白修饰的研究，所需细胞数量较少至中等（5 x 104 - 5 × 105 细胞）。重要的是，该方案可与采用标准文库构建方法的ChIP-seq技术兼容，从而可在高度相关的胚胎组织中获得全基因组范围的表观基因组图谱。
引言
组蛋白翻译后修饰直接参与多种染色质依赖性过程，包括转录、复制和DNA修复1,2,3。此外，不同的组蛋白修饰与基因表达呈正相关（例如，H3K4me3 和 H3K27ac）或负相关（例如，H3K9me3 和 H3K27me3），可分别被广泛定义为激活型或抑制型组蛋白标记2,3。因此，全基因组组蛋白修饰图谱（也称为表观基因组图谱）已成为功能注释脊椎动物基因组的强大且通用的工具4,5。例如，可根据特定染色质特征（例如，活性增强子：H3K4me1 和 H3K27ac）识别远端调控序列（如增强子），从而将其与近端启动子区域（例如，活性启动子：H3K4me3）区分开来6,7,8。另一方面，具有重要细胞身份调控功能的基因通常位于广阔的染色质结构域中，这些结构域根据其下方基因的....
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方案
根据德国动物护理指南，进行鸡胚实验无需获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。根据当地规定，仅对HH44期（18天）及更晚期的鸡胚进行的实验才需要IACUC批准。然而，本研究中使用的所有胚胎均处于较早的胚胎发育阶段（即， HH19（72 小时）
注意：本实验方案的目的是对染色质免疫沉淀（ChIP）实验进行详细描述，以便有效结合定量PCR或下一代测序（即， ChIP-seq）用于研究低丰度胚胎样本中的组蛋白修饰（样本量范围为 5 x 104 - 5 × 105 每次ChIP反应的细胞数）以及不同组织类型（图1）。该方案应适用于研究转录因子和共激活因子的结合特征例如， p300）。然而，由于这些调控蛋白的丰度较低，可能需要更多的细胞数量（5 x 105 - 5 × 106 每次ChIP反应所需的细胞数）。
1. 鸡胚的准备及脊索神经管（SNT）的显微解剖
注意：显微解剖的操作步骤因组织类型和动物模型的不同而有所差异。本节以获取HH19期鸡胚臂丛脊神经节（SNT）切片为例，详细描述所采用的解剖方案。
- 从当地饲养者处获取受精的白来航鸡鸡蛋，以....
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结果
为展示本ChIP方案的性能，我们利用HH19鸡胚的 pooled SNT切片、HH22鸡胚的上颌突以及HH3期鸡胚组织开展了ChIP-seq实验，以研究多种组蛋白修饰的结合图谱即， H3K4me2、H3K27ac、H3K4me3 和 H3K27me3）。在获得ChIP DNA后，通过对应输入DNA的琼脂糖凝胶电泳评估超声破碎效率（图3）。随后，利用染色质免疫沉淀（ChIP）和输入（input）DNA 进行 ChIP-qPCR 分析，以检测目标组蛋白修饰预期结合或非结合位点的富集情况图 4A）。在所示的示例中 图 4A在HH19期SNT切片中，通过ChIP-qPCR检测了SOX17和SOX2基因启动子区域周围的H3K27me3和H3K4me3富集水平，这两个基因在SNT中分别为失活和活化状态。正如预期，SOX2启动子区域被H3K4me3显著标记，而未被H3K27me3标记；SOX.......
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讨论
利用ChIP-seq对组蛋白修饰进行表观基因组学分析，可用于在不同细胞背景下改进脊椎动物基因组的功能注释4,5,18这些表观基因组谱可用于识别增强子元件，以及定义增强子的调控状态（即， 活性、启动或预备状态），并在不同的生物学或病理学背景下定义主要的细胞身份调控因子（例如， 宽泛的H3K4me3启动子区域和超级增强子6,7,9,10,11,19然而，由于ChIP实验本身存在局限性，通常需要数百万个细胞，大多数组蛋白修饰谱的生成.......
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披露
作者无任何需披露的相互竞争的经济利益。
致谢
作者感谢 Jan Appel 在本方案建立过程中提供的出色技术支持。Rada-Iglesias 实验室的工作得到了 CMMC 机构内资助、德国研究基金会研究资助（RA 2547/1-1、RA 2547/2-1 和 TE 1007/3-1）、科隆大学高级研究员小组资助以及 CECAD 资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| BSA 粉末 | Carl Roth | 3737.3 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCl pH 8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-月桂酰肌氨酸 | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/磁珠 | Invitrogen | 1004D | |
| 37% 甲醛 | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| 甘氨酸 | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| 蛋白酶 K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| 丁酸钠 | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 5892791001 | |
| SYBR Green 混合液 | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1 Kb DNA 标准分子量标记 | Thermofisher | SM1333 | |
| 橙色 G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x) | Gibco | 25200-072 | |
| 辛基酚聚氧乙烯醚（Triton X-100） | Roth | 3051.4 | |
| DMEM（Dulbecco´s 改良伊格尔培养基） | Gibco | 31331-028 | |
| 凝胶加样枪头 Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR 板 | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 孔板 | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL 离心管 | Sarstedt | 72,706 | |
| 100 - 1,000 µL 滤芯枪头 | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2 - 20 µL 滤芯枪头 | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2 - 200 µL 滤芯枪头 | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5 - 10 µL 滤芯枪头 | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 抗体 | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac 抗体 | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 抗体 | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 抗体 | Active Motif | 39141 | |
| 末端修复混合液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| 顺磁性磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 重悬缓冲液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| A 尾添加混合液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| 连接混合液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA 接头索引 | Illumina | RS-122-2101 | |
| 终止连接缓冲液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR 引物混合液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| 增强型 PCR 混合液 | Illumina | FC-121-4001 | |
| 基因组 DNA 标准分子量标记 | Agilent | 5067-5582 | |
| 洗脱缓冲液 | Agilent | 19086 | |
| 上样缓冲液 | Agilent | 5067-5582 | |
| 文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| 受精白壳鸡胚蛋 | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| 注射针头（Neoject） | A.Hartenstein | 10001 | |
| 注射器（Ecoject 10 mL） | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 离心机 | Hermle | Z 216 MK | |
| 恒温振荡器 | ITABIS | MKR13 | |
| 超声破碎仪 | Active Motive | EpiShear 探头式超声破碎仪 | |
| 超声破碎仪 | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| 旋转混合仪 | Stuart | SB3 | |
| 可调体积移液器（5 –1,000 μL） | Eppendorf | N/A | |
| 计时器 | Sigma | N/A | |
| 磁力架 | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| 台式离心机 | Heathrow Scientific | Sprout | |
| 混合器 | LMS | VTX 3000L | |
| 实时荧光定量 PCR 仪 | Roche | Light Cycler；序列号 5662 | |
| PCR 仪 | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA 和 RNA 质量控制系统 | Agilent | Agilent 4200 TapeStation 系统 | |
| 镊子 | Dumont | 5-Inox-H | |
| 带孔勺 | World precision instruments | 501997 |
参考文献
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K.
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重印与许可
