Simpel fjernelse af baggrunden fluorescens i Formalin-fast menneskelige hjernevæv til immunofluorescens mikroskopi
Summary
Baggrund autofluorescence biologiske prøver komplicerer ofte fluorescens-baserede Billeddannende teknikker, især i alderen postmitotic væv. Denne protokol beskriver hvordan autofluorescence fra disse prøver kan fjernes effektivt ved hjælp af en kommercielt tilgængelig lysemitterende diode lys kilde til photobleach prøven før immunfarvning.
Abstract
Immunfluorescens er en fælles metode, der bruges til at visualisere subcellulært rum og bestemme lokalisering af specifikke proteiner inden en vævsprøve. En stor hindring for erhvervelsen af høj kvalitet immunofluorescens billeder er endogene autofluorescence af væv forårsaget af ældning pigmenter såsom lipofuscin eller fælles prøve forberedelse processer såsom aldehyd fiksering. Denne protokol beskriver, hvordan baggrunden fluorescens kan være stærkt reduceret gennem photobleaching ved hjælp af hvid fosfor light emitting diode (LED) arrays inden behandling med fluorescerende sonder. Bredspektret emission af hvid fosfor lysdioder giver mulighed for blegning af fluorophores på tværs af en vifte af emission toppe. Photobleaching apparat kan være fremstillet af off-the-shelf komponenter til en meget lav pris og giver en tilgængelige alternativ til kommercielt tilgængelige kemiske quenchers. En photobleaching forbehandling af vævet efterfulgt af konventionelle immunofluorescens farvning genererer billeder gratis baggrund autofluorescence. I forhold til etableret kemiske quenchers, som reducerede sonde samt baggrund signaler, photobleaching behandling havde ingen effekt på sonden fluorescens intensitet, mens det effektivt reduceret baggrund og lipofuscin fluorescens. Selvom photobleaching kræver mere tid til forbehandling, kan højere intensitet LED arrays bruges til at reducere photobleaching tid. Denne enkle metode kan potentielt anvendes til en bred vifte af væv, især postmitotic væv, der ophobes lipofuscin som hjernen, og hjerte- eller skelet muskler.
Introduction
Fluorescens mikroskopi af antistoffer rettet mod specifikke proteiner bruges rutinemæssigt til at visualisere proteiner af interesse i cellekultur og væv. En væsentlig komplikation til erhvervelse af klare og endelige billeder i immunofluorescens er autofluorescence, som kan være forårsaget endogent i pattedyrvæv alder pigment lipofuscin og proteiner som elastin og kollagen1, 2. Andre kilder til autofluorescence kan indføres gennem prøven forberedelsestrin såsom aldehyd fiksering3. Lipofuscin granulat, sammensat primært af oxidativt modificerede proteiner og lipid nedbrydning restkoncentrationer, ophobes i lang-levende celler med øget alder2. Dette medfører vanskeligheder i imaging postmitotic væv af hjerne og hjerte eller skelet muskler, som fluorescens emission spektrum af lipofuscin er bred og variable, ofte sammenfaldende med emission bølgelængde af fælles fluorophores anvendes til mærkning4. Disse faktorer gør billeddannelse af menneskelige hjernevæv fra tilfælde af sent indsættende neurodegenerative sygdomme som frontotemporal lobar degeneration (FTLD) især udfordrende.
For at reducere autofluorescence, har vi udviklet en teknik, hvor vi bestråle afsnittene slide-monteret væv med en hvid lysemitterende (LED) diodearray ved brug af en husholdnings desk lamp5. Denne enkle teknik giver et alternativ til teknikker, der bruger kemiske quenchers såsom CuSO4 ammoniumacetat, eller kommercielt tilgængelige quenching farvestoffer som Sudan Black B og Eriochromsort sort T6. Det har også betydelige besparelser over multispektrale LED lampe photobleaching teknikker og undgår komplikationer og artefakter genereret fra digital autofluorescence fjernelse metoder såsom spektrale un-blanding7,8. Hvid fosfor lysdioder har en bred emission spektrum, høj lysstyrke og lave produktionsomkostninger, hvilket gør dem ideelle som en off-the-shelf komponent for photobleaching en række lysopfangende5,9.
I denne protokol, vi demonstrere opførelsen af et photobleaching apparat ved hjælp af tilgængelige komponenter og anvende photobleaching på en sag af FTLD væv indeholdende tau-positive indeslutninger (FTLD-T) ved hjælp af en antistof specifik for fosforyleres tau. Vi demonstrere effekten af photobleaching på imaging fluorescently mærket antistoffer beskæftiger to almindeligt anvendte lysopfangende: Alexa 488 og Texas rød. Effekten af photobleaching versus ubehandlet sektioner eller disse blev behandlet med en kommerciel kemiske quencher er kvantificeret og sammenlignet. Denne photobleaching forbehandling kan indarbejdes i enhver standard immunofluorescens farvnings-protokollen til at fjerne autofluorescence i en biologisk prøve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Photobleaching forbehandling af væv, der er beskrevet i dette håndskrift giver mulighed for effektiv fjernelse af autofluorescence ved hjælp af off-the-shelf komponenter. Protokollen beskriver immunofluorescens billeddannelse af fosforyleres tau aggregater i formalin-fast menneskelige hjernevæv ved hjælp af sekundære antistoffer konjugeret til Alexa 488 og Texas rød, med DAPI som en nuklear kontrastfarve. For at anvende metoden til andre væv, anbefaler vi udfører en 48 h photobleaching forbehandling til prøven …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet i hele eller en del af den canadiske konsortium af Neurodegeneration og aldring (CCNA), det canadiske Institut for sundhed Research (CIHR), ALS Society of Canada (ALS Canada) og Alzheimers samfund i Canada (ASC). Forfatterne vil gerne takke Sultan Darvesh og Andrew Reid fra Maritime hjernen væv banken til at yde FTLD hjernen væv, Milano Ganguly fra programmet Spatio-temporale målretning og forstærkning af stråling svar (STTARR) og dens tilknyttede finansiering agenturer for væv indlejring og skæring tjenester, og den avancerede Optisk mikroskopi facilitet (AOMF) for at give mikroskopi instrumenter. Kevin Hadley er takkede for kritisk gennemgang af håndskriftet.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).
- Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).
- Ottis, P., Koppe, K., et al. Human and rat brain lipofuscin proteome. Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).
- Sun, Y., Chakrabartty, A. Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array. Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).
- Davis, A. S., Richter, A., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).
- Duong, H., Han, M. A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy. J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).
- Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies. J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).
- Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy. Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).
