Protokol til fastfasesyntese af oligomerer af RNA indeholdende en 2'-<em> O</em> -thiophenylmethyl-modifikation og karakterisering via cirkulær dikroisme
Summary
Denne artikel tilvejebringer en detaljeret fremgangsmåde til fastfasesyntese, oprensning og karakterisering af dodecamerer af RNA modificeret ved C2'- O- stillingen. UV-vis og cirkulær dikroisme fotometriske analyser bruges til at kvantificere og karakterisere strukturelle aspekter, dvs. enkeltstrenger eller dobbeltstrenger.
Abstract
Fastfasesyntese er blevet anvendt til at opnå kanoniske og modificerede polymerer af nukleinsyrer, specifikt DNA eller RNA, som har gjort det til en populær metode til applikationer inden for forskellige felter og til forskellige forskningsformål. Fremgangsmåden beskrevet heri fokuserer på syntese, oprensning og karakterisering af dodecamerer af RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' indeholdende nul, en eller to modifikationer placeret ved C2'- O- positionen. Proberne er baseret på 2-thiophenylmethylgrupper, inkorporeret i RNA-nukleotider via standard organisk syntese og indført i de tilsvarende oligonukleotider via deres respektive phosphoramiditter. Denne rapport benytter fosforamiditkemi via de fire kanoniske nukleobaser (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)) såvel som 2-thiophenylmethyl-funktionaliserede nucleotider modificeret ved 2'- O- position; Metoden er imidlertid acceptabel for en stor varHalvtreds af ændringer, der er blevet udviklet gennem årene. Oligonukleotiderne blev syntetiseret på en styret poreglas (CPG) bærer efterfulgt af spaltning fra harpiksen og afbeskyttelse under standardbetingelser, dvs. en blanding af ammoniak og methylamin (AMA) efterfulgt af hydrogenfluorid / triethylamin / N-methylpyrrolidinon. De tilsvarende oligonukleotider blev oprenset via polyacrylamid-elektroforese (20% denaturering) efterfulgt af eluering, udblødning, og isolering via omvendt fase-kromatografi (Sep-pak, C18-søjle). Kvantificering og strukturelle parametre blev vurderet via henholdsvis ultraviolet synlig (UV-vis) og cirkulær dikroisme (CD) fotometrisk analyse. Denne rapport sigter mod at tjene som en ressource og vejledning til nybegyndere og eksperter, der er interesserede i at gå i gang på dette område. Det forventes at fungere som et arbejde i gang, da der udvikles nye teknologier og metoder. Beskrivelsen af metoder og teknikker inden for denneS dokument svarer til en DNA / RNA synthesizer (renoveret og købt i 2013), der bruger phosphoramidit kemi.
Introduction
Fastfasesyntese til opnåelse af oligonukleotider af DNA / RNA er et kraftfuldt værktøj, der har tjent adskillige anvendelser på forskellige felter siden 1970'erne 1 , 2 , 3 ved anvendelse af phosphoramidit byggesten 4 . Eksempler på dens brede indflydelse er: dets indvirkning på mærkning ( via klikkemiske reaktioner) 5 , strukturundersøgelse 6 og antisense teknologier 7 samt dets belysning af biologiske mekanismer 8 , 9 , kilde som genetisk materiale 10 og undersøgelsen af Forskellige naturlige og / eller kemiske modifikationer 11 , 12 blandt mange andre. Modifikationen, som vi bruger her, repræsenterer det første trin i vores bestræbelser på at opnå RNA-oligonukleotider, som indeholderFotoaktive prober for at muliggøre temporær kontrol af struktur og funktion af denne vigtige biopolymer.
Syntesen af RNA dodecamers med sekvenser: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [august AUU CCG UAG] -3' (understregede positioner repræsenterer inkorporering af et C2'- O -thiophenylmethyl modifikation ) Udgør fokus for denne undersøgelse. Sekvenserne blev valgt til at muliggøre kvantificering og måling af RNA-tråde som enkelte tråde eller som deres tilsvarende duplexstrukturer (ingen andre sekundære strukturer blev forudsagt som termodynamisk stabile). CD blev brugt til at etablere strukturelle parametre, dvs. duplexdannelse og termiske denatureringsovergange.
syntese
Den overordnede fremgangsmåde til opnåelse af disse oligonukleotider er illustreret i figur 1 og følger den trinvise proces: automatiseret fastfasesyntese → DeprOtektion → oprensning → kvantificering → karakterisering. Figur 2 viser de monomere enheder, der er nødvendige i denne procedure. Fastfasesyntese af RNA svarer til DNA-molekylet, idet den er baseret på phosphoramiditkemi ( figur 2 , venstre) og anvendelsen af baselabile beskyttelsesgrupper for de nukleofile exocykliske aminer på G, A og C, f.eks . Acetyl, benzoyl, phenoxyacetyl, t- butyl eller N , N- dimethylformamid ( figur 2 , højre). Et yderligere aspekt at overveje i RNA på grund af tilstedeværelsen af C2'-OH-gruppen (mangler i deoxyoligonukleotidbiopolymererne) er det yderligere trin, der skal inkorporeres til beskyttelse og efterfølgende afbeskyttelse af denne nukleofile position. I denne henseende er siliciumbaserede beskyttelsesgrupper blevet en attraktiv strategi på grund af deres potentiale som biorthogonale dele (specificallY afbeskyttet i nærvær af fluorid), med tert- butyldimethylsilyl (TBDMS) og triisopropylsilyloxymethyl (TOM) grupper som populære valg ( figur 2 , nederst til venstre).
I dette arbejde blev den automatiserede syntese udført på en DNA / RNA synthesizer, der anvender standard phosphoramiditkemi. Fabrikantens indstillinger på instrumentet inkluderer et automatiseret fortyndingstrin, når de kommercielle versioner af phosphoramiditerne anvendes til DNA, eller muligheden for at fortynde ved mængder indstillet af brugeren. Imidlertid besluttede vi at veje RNA phosphoramidit og fortyndes manuelt, idet: 1) prisen på de kanoniske phosphoramiditter af RNA er højere (op til 50 gange dyrere i nogle tilfælde); 2) de modificerede phosphoramiditter opnås ofte i små mængder; Og 3) mængden af spildt materiale ved anvendelse af et automatiseret fortyndingstrin (angivet af producenten) er stor. Derudover anvendte vi: 1) kommercielt tilgængelige faste bærere( Fx CPG) indeholdende en beskyttet nukleobase for at fungere som 3'-enden; Og 2) kommercielle phosphoramiditter (kanoniske nukleobaser) beskyttet med en TBDMS-gruppe ved C2'- O- positionen. Den detaljerede liste over syntesetrinene er tilvejebragt i figur 3 og tabel 1 sammen med yderligere beskrivelse og kommentarer til trin, som blev justeret for RNA-syntesen. Endvidere illustrerer figur 4 de trinvise udbytter, der observeres for hvert trin efter valg af 'Trityl Monitor'-indstillingen, som kvantificerer trityl-kationen frigivet fra hvert detrityleringstrin.
Det er værd at bemærke, at den begrænsende faktor typisk efter vores opfattelse opnåede phosphoramiditten indeholdende den ønskede modifikation. Det vil sige udviklingen af en syntetisk metode, der muliggør inkorporering af modifikationer på udvalgte steder. I denne rapport fokuserer vi påInkorporering af et modificeret nukleotid, for hvilket vi har etableret den tilsvarende syntetiske metode, C2'- O- thiophenylmethylgruppen. Denne gruppe er lille i størrelse og påvirker ikke fastfasesyntesen på nogen måde. Da inkorporeringen af denne gruppe i oligonukleotider af RNA er blevet rapporteret sammen med strukturelle og termodynamiske parametre 4 , vil der ikke blive beskrevet nogen aspekter af den organiske syntese der fører til de modificerede phosphoramiditter heri.
Afbeskyttelse, oprensning og karakterisering
Afbeskyttelsen af de exocykliske aminer og ß-cyanoethylgrupper forekommer i samme trin som spaltningen fra CPG-harpiksen. Vi anvendte de almindeligt anvendte betingelser for opvarmning af den opnåede harpiks i nærværelse af en vandig opløsning af AMA efterfulgt af spaltning af C2'- O- silylgrupperne i nærværelse af fluoridioner og derefter oprensning via gelelektroforese. Mens disse er blevet standardbetingelser i mange tilfælde, modifikationer, der er labile for basiske betingelser eller fluoridioner kan kræve mildere betingelser 13, 14, fx methanol / kaliumcarbonat (MeOH / K2CO 3), eller butylamin. Således er et andet sæt beskyttelsesgrupper på de tilsvarende phosphoramiditter nødvendigt. Desuden valgte vi elektroforese som det foretrukne alternativ til at rense de afbeskyttede oligomerer i betragtning af vores tidligere erfaring med denne metode og manglen på anden instrumentering. HPLC kan imidlertid alternativt anvendes som en effektiv metode 15 . Karakterisering af de oprensede oligonukleotider blev udført via massespektrometri, matrixassisteret laser desorption / ioniserings-tid for flyvning (MALDI-TOF) ved anvendelse af en rapporteret procedure af vores gruppe 16 .
Strukturel karakterisering og deraf Mal stabilitet af de opnåede duplexer blev udført via CD. Specifikt bruger vi CD til at bestemme de termiske denatureringsovergange af modificerede og umodificerede oligonukleotider af RNA ved at følge nedgangen i båndets ellipticitet ved ca. 270 nm, samt båndets forsvinden (med negativ ellipticitet) med en A max ved 210 nm. En spektra sammenligning før og efter hybridisering er tilvejebragt for at illustrere deres forskelle og tilvejebringe validering af den anvendte metode. Anvendelsen af CD er almindeligt accepteret ved bestemmelsen af strukturelle motiver i nukleinsyrer og aminosyrer 17 og kan derfor anvendes som et redskab til at bestemme forskellige strukturelle og termodynamiske parametre 18 ; Der er dog ikke mange eksempler, hvor teknikken bruges til at vurdere termiske denatureringsovergange. Nogle tilfælde omfatter bestemmelse af termiske stabiliteter på DNA, der indeholder G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplex og hårnåle af RNA 21 .
Denne rapport har til hensigt at give den ikke-ekspertlæser eller seer et sæt værktøjer, der gør det muligt at starte denne type forskning smidigt. Det vil tjene til at forbedre og sammenligne med metoder og teknikker hos andre forskningslaboratorier, der er involveret i denne spændende videnskab. Indholdet i denne rapport tilføjer til de eksisterende protokoller fra denne teknologi fra forskellige kilder, og beriger og letter erfaringen med et visuelt hjælpemiddel til hvert trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med dette manuskript er at tjene som en vejledning til forskere på området, nybegynder eller ekspert, med succes at opnå eller forbedre syntesen af oligonukleotider af DNA eller RNA. Den beskrevne metode fokuserer på anvendelsen af fastfasesyntese under anvendelse af en automatiseret DNA / RNA-syntetisator via standard phosphoramiditkemi. Rapporten beskriver en trinvis skildring af syntesen, oprensningen og karakteriseringen af RNA-dodecamererne. Derudover anvendes brugen af CD til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forberedelse af dette manuskript blev støttet via startfonde fra University of Colorado Denver (JMRE). AF vil gerne anerkende støtte fra en Research and Creative Activities-pris (RaCAS, CU Denver). Finansiering fra Office of Research Services, University of Colorado Denver til dækning af publikationsgebyrer er anerkendt. Vi vil gerne takke labmedlemmerne Cassandra Herbert og Mr. Yannick K. Dzowo for deres bidrag i videodelen.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
