Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2'-<em> O</em> -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme
Summary
Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.
Abstract
Solide fase synthese is gebruikt om kanonieke en gemodificeerde polymeren van nucleïnezuren, specifiek van DNA of RNA, te verkrijgen, waardoor het een populaire methodologie is voor toepassingen in verschillende velden en voor verschillende onderzoeksdoeleinden. De hierin beschreven procedure richt zich op de synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' die nul, een of twee modificaties bevinden op de C2'- O- positie bevatten. De probes zijn gebaseerd op 2-thiophenylmethylgroepen, opgenomen in RNA-nucleotiden via standaard organische synthese en geïntroduceerd in de overeenkomstige oligonucleotiden via hun respectievelijke fosforamidieten. Dit rapport maakt gebruik van fosforamidietchemie via de vier kanonieke nucleobasen (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), evenals 2-thiophenylmethylfunctionaliseerde nucleotiden gemodificeerd bij de 2'- O- positie; De methode is echter vatbaar voor een grote varZestig aanpassingen die door de jaren heen zijn ontwikkeld. De oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een steun met gecontroleerde poriënglas (CPG), gevolgd door splitsing uit de hars en deprotectie onder standaard omstandigheden, dat wil zeggen een mengsel van ammoniak en methylamine (AMA) gevolgd door waterstoffluoride / triethylamine / N-methylpyrrolidinon. De overeenkomstige oligonucleotiden werden gezuiverd via polyacrylamide-elektroforese (20% denaturerende) gevolgd door elutie, ontzouten en isolatie via omgekeerde fase chromatografie (Sep-pak, C18-kolom). Kwantificering en structurele parameters werden beoordeeld via respectievelijk ultraviolet-zichtbare (UV-vis) en circulaire dichroïstische (CD) fotometrische analyse. Dit rapport streeft ernaar om als bron en begeleider te dienen voor beginners- en deskundige onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het starten van dit vakgebied. Er wordt verwacht dat deze werkzaamheden worden ingezet als nieuwe technologieën en methodologieën worden ontwikkeld. De beschrijving van de methodologieën en technieken binnen dezeS document komt overeen met een DNA / RNA synthesizer (opgeknapt en gekocht in 2013) die fosforamidietchemie gebruikt.
Introduction
Solid-fase synthese om oligonucleotiden van DNA / RNA te verkrijgen is een krachtig hulpmiddel dat sinds de jaren 1970 1 , 2 , 3 verscheidene toepassingen in verschillende velden heeft gediend door fosforamidiet bouwstenen 4 te gebruiken . Voorbeelden van zijn brede invloed zijn: het effect ervan op etikettering ( via click chemistry reacties) 5 , structurele probing 6 en antisense technologieën 7 , evenals de toelichting van biologische mechanismen 8 , 9 , bron als genetisch materiaal 10 , en de studie van Verschillende natuurlijke en / of chemische wijzigingen 11 , 12 , onder vele anderen. De wijziging die we hier gebruiken, vertegenwoordigt de eerste stap in onze inspanningen om RNA-oligonucleotiden te verkrijgen die bevattenFotoactieve probes om tijdelijke controle van de structuur en functie van dit belangrijke biopolymeer mogelijk te maken.
De synthese van RNA-sequenties met dodecameren: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [augustus AUU CCG UAG] -3' (onderstreept posities vertegenwoordigt de opname van een C2'- O -thiophenylmethyl modificatie ) Vormt de focus van deze studie. De sequenties werden gekozen om de kwantificering en meting van RNA-strengen mogelijk te maken als enkele strengen, of als hun corresponderende duplexstructuren (geen andere secundaire structuren werden voorgesteld als thermodynamisch stabiel). CD werd gebruikt om de structurele parameters te bepalen, dwz duplexvorming en thermische denaturatieovergangen.
Synthese
De algemene werkwijze voor het verkrijgen van deze oligonucleotiden is geïllustreerd in Figuur 1 en volgt de stapsgewijze werkwijze: geautomatiseerde vaste-fase synthese → DeprOtectie → zuivering → kwantificering → karakterisering. Figuur 2 toont de monomeereenheden die nodig zijn in deze procedure. De vaste-fase synthese van RNA is vergelijkbaar met die van DNA, omdat het gebaseerd is op fosforamidietchemie ( Figuur 2 , links) en het gebruik van base-labiele beschermende groepen voor de nucleofiele exocyclische aminen op G, A en C, bijvoorbeeld , Acetyl, benzoyl, fenoxyacetyl, t- butyl of N , N- dimethylformamide ( Figuur 2 , rechts). Nog een aspect om te overwegen in RNA, door de aanwezigheid van de C2'-OH groep (ontbreekt in de deoxyoligonucleotide biopolymeren), is de aanvullende stap die moet worden opgenomen voor de bescherming en de daaropvolgende afbescherming van deze nucleofiele positie. In dit opzicht zijn silicium gebaseerde beschermende groepen uitgegroeid tot een aantrekkelijke strategie door hun potentieel als biorthogonale delen (specificallY beschermd in aanwezigheid van fluoride), met de tert- butyldimethylsilyl (TBDMS) en triisopropylsilyloxymethyl (TOM) groepen als populaire keuzes ( Figuur 2 , linksonder).
In dit werk werd de geautomatiseerde synthese uitgevoerd op een DNA / RNA synthesizer die standaard fosforamidietchemie gebruikt. De fabrikantinstellingen op het instrument omvatten een geautomatiseerde verdunningsstap bij het gebruik van de commerciële versies van de fosforamidieten voor DNA, of de mogelijkheid om te verdunnen bij volumes die door de gebruiker zijn ingesteld. We hebben echter besloten om het RNA fosforamidiet te wegen en handmatig te verdunnen, omdat: 1) de prijs van de kanonische fosforamidieten van RNA hoger is (in sommige gevallen tot 50 keer duurder); 2) de gemodificeerde fosforamidieten worden vaak in kleine hoeveelheden verkregen; En 3) het bedrag van verspild materiaal bij gebruik van een geautomatiseerde verdunningsstap (ingesteld door fabrikant) is groot. Daarnaast hebben we gebruikt: 1) in de handel verkrijgbare vaste steunen( Bijv . CPG) die een beschermde nucleobase bevat om als het 3'-einde te functioneren; En 2) commerciële fosforamidieten (kanonieke nucleobasen) beschermd met een TBDMS-groep op de C2'- O- positie. De gedetailleerde lijst van de synthese stappen wordt verschaft in Figuur 3 en Tabel 1 , samen met verdere beschrijving en opmerkingen voor stappen die zijn aangepast voor de RNA synthese. Figuur 4 illustreert verder de stapsgewijze opbrengsten die worden waargenomen voor elke stap na het selecteren van de 'Trityl Monitor' optie, die de trityl kation kwantitatief vrijgegeven van elke detritylatiestap kwantificeert.
Het is op te merken dat typisch, in onze ervaring, de beperkende factor was het verkrijgen van de fosforamidiet die de gewenste modificatie bevat. Dat is de ontwikkeling van een synthetische methodologie die het mogelijk maakt om wijzigingen op geselecteerde locaties op te nemen. In dit rapport richten wij ons op deIncorporation van een gemodificeerd nucleotide waarvoor we de bijbehorende synthetische methodologie, de C2'- O- thiophenylmethylgroep hebben vastgesteld. Deze groep is klein in grootte en heeft geen invloed op de vaste-fase synthese op welke manier dan ook. Aangezien de opneming van deze groep in oligonucleotiden van RNA is gemeld, samen met structurele en thermodynamische parameters 4 , worden hierin geen aspecten van de organische synthese die leidt tot de gemodificeerde fosforamidieten beschreven.
Deprotectie, zuivering en karakterisering
De afbescherming van de exocyclische aminen en ß-cyanoethylgroepen komt in dezelfde stap als die van de splitsing van de CPG-hars voor. Wij hebben de gebruikelijke omstandigheden toegepast om de verkregen hars te verhitten in aanwezigheid van een waterige oplossing van AMA, gevolgd door splitsing van de C2'- O- silylgroepen in aanwezigheid van fluorideionen en vervolgens zuivering via gelelektroforese. Terwijl deze standaardomstandigheden vaak modificaties die labiel basische omstandigheden of fluoride-ionen mildere omstandigheden 13, 14, bijvoorbeeld methanol / kaliumcarbonaat (MeOH / K 2 CO 3) of butylamine nodig zijn geworden. Zo is een andere groep beschermende groepen op de overeenkomstige fosforamidieten nodig. Verder hebben we gekozen voor elektroforese als het voorkeursalternatief om de beschermde oligomeren te zuiveren, gezien onze vorige ervaring met deze methode en het gebrek aan andere instrumenten. HPLC kan echter alternatief gebruikt worden als een effectieve methode 15 . Karakterisering van de gezuiverde oligonucleotiden werd uitgevoerd via massaspectrometrie, matrix geassisteerde laser desorptie / ionisatietijd van de vlucht (MALDI-TOF), onder toepassing van een gerapporteerde procedure door onze groep 16 .
Structurele karakterisering en daarbij Mal stabiliteit van de verkregen duplexen werden uitgevoerd via CD. Specifiek maken we gebruik van CD om de thermische denaturatieovergangen van gemodificeerde en ongewijzigde oligonucleotiden van RNA te bepalen door de afname van de ellipticiteit van de band te bepalen bij ca. 270 nm, evenals de verdwijning van de band (met negatieve ellipticiteit) met een A max bij 210 nm. Een spectra vergelijking voor en na hybridisatie wordt verschaft om hun verschillen te illustreren en de validatie van de werkmethodologie te verschaffen. Het gebruik van CD wordt algemeen geaccepteerd bij de bepaling van structurele motieven in nucleïnezuren en aminozuren 17 en kan derhalve worden gebruikt als hulpmiddel om diverse structurele en thermodynamische parameters 18 te bepalen ; Er zijn echter niet veel voorbeelden waar de techniek wordt gebruikt om thermische denaturatieovergangen te beoordelen. Sommige gevallen omvatten de bepaling van thermische stabiliteit op DNA dat G-quadruplexen bevatAss = "xref"> 19 , 20 of in duplexen en haarspelden van RNA 21 .
Dit rapport is bedoeld om de niet-deskundige lezer of kijker te voorzien van een aantal instrumenten die een goed begin van dit soort onderzoek mogelijk maken. Het zal dienen om te verbeteren en te vergelijken met methodologieën en technieken bij andere onderzoekslaboratoria die betrokken zijn bij deze opwindende wetenschapswetenschap. De inhoud van dit rapport voegt aan de bestaande protocollen van deze technologie uit verschillende bronnen toe, en verrijkt en vergemakkelijkt de ervaring met een visuele hulpmiddel voor elke stap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit manuscript is om als gids te dienen voor onderzoekers op het gebied, beginner of deskundige, om succesvol het bereiken of verbeteren van de synthese van oligonucleotiden van DNA of RNA. De beschreven methodologie richt zich op het gebruik van vaste-fase synthese door gebruik te maken van een geautomatiseerde DNA / RNA synthesizer via standaard fosforamidiet chemie. Het rapport beschrijft een stap-voor-stap afbeelding van de synthese, zuivering en karakterisering van RNA dodecamers. Daarnaast wordt het g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Voorbereiding van dit manuscript werd ondersteund via start-up fondsen van de Universiteit van Colorado Denver (JMRE). AF zou graag willen steunen van een award voor onderzoek en creatieve activiteiten (RaCAS, CU Denver). Financiering van het Bureau van Onderzoeksdiensten, Universiteit van Colorado Denver om publicatiekosten te dekken, wordt erkend. Wij danken de leden van het lab mevrouw cassandra herbert en meneer yannick k. dzowo voor hun bijdragen in het videogedeelte.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
