Protocole pour la synthèse en phase solide d'oligomères d'ARN contenant un 2'-<em> O</em> -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire
Summary
Cet article fournit une procédure détaillée sur la synthèse en phase solide, la purification et la caractérisation des dodecamères d'ARN modifiés à la position C2'- O . Les analyses photométriques UV-vis et dichroïstiques circulaires sont utilisées pour quantifier et caractériser les aspects structurels, c'est -à-dire les brins simples ou à double brin.
Abstract
La synthèse en phase solide a été utilisée pour obtenir des polymères canoniques et modifiés d'acides nucléiques, en particulier d'ADN ou d'ARN, ce qui en fait une méthodologie populaire pour des applications dans divers domaines et à des fins de recherche différentes. La procédure décrite ici se concentre sur la synthèse, la purification et la caractérisation des dodecamères de l'ARN 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contenant zéro, une ou deux modifications situées à la position C2'- O . Les sondes sont basées sur des groupes 2-thiophénylméthyle, incorporés dans des nucléotides d'ARN par synthèse organique standard et introduits dans les oligonucléotides correspondants via leurs phosphoramidites respectifs. Ce rapport utilise la chimie de la phosphoramidite via les quatre nucléobases canoniques (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), ainsi que les nucléotides fonctionnalisés au 2-thiophénylméthyle modifiés au 2'- O- position; Cependant, la méthodologie est susceptible d'un grand varPlusieurs modifications qui ont été développées au cours des années. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un support de verre à pores contrôlés (CPG) suivi d'un clivage de la résine et de la déprotection dans des conditions standard, c'est -à- dire un mélange d'ammoniac et de méthylamine (AMA) suivi par du fluorure d'hydrogène / triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone. Les oligonucleotides correspondants ont été purifiés par électrophorèse sur polyacrylamide (dénaturant 20%) suivie d' une élution, le dessalage, et l' isolement par Chromatographie en phase inverse (Sep-pak, C 18 -column). La quantification et les paramètres structurels ont été évalués par analyse photométrique par dichroïsme circulaire (CD-UV) vis-à-vis de l'ultraviolet (UV-vis) et respectivement. Ce rapport vise à servir de ressource et de guide pour les chercheurs débutants et experts intéressés à s'engager dans ce domaine. On s'attend à ce qu'il serve de travail en cours au fur et à mesure que de nouvelles technologies et méthodologies sont développées. La description des méthodologies et des techniques au sein deS document correspond à un synthétiseur ADN / ARN (remis à neuf et acheté en 2013) qui utilise la chimie de la phosphoramidite.
Introduction
La synthèse en phase solide pour obtenir des oligonucléotides d'ADN / ARN est un outil puissant qui a servi plusieurs applications dans différents domaines depuis les années 1970, 1 , 2 , 3 en utilisant des blocs de construction de phosphoramidite 4 . Parmi les exemples de sa large influence figurent: son impact sur l'étiquetage ( via les réactions de la chimie de clic) 5 , la sondage structurel 6 et les technologies antisens 7 , ainsi que son élucidation des mécanismes biologiques 8 , 9 , sources de matériel génétique 10 et l'étude de Diverses modifications naturelles et / ou chimiques 11 , 12 , entre autres. La modification que nous utilisons ici représente la première étape dans nos efforts pour obtenir des oligonucléotides d'ARN qui contiennentSondes photoactives pour permettre le contrôle temporel de la structure et de la fonction de cet important biopolymère.
La synthèse de dodécamères d'ARN avec des séquences: 5 '- [ACU CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [août AUU GCC UAG] -3' (positions soulignées représentent l'incorporation d'un C2'- O modification de -thiophenylmethyl ) Constitue l'objet de cette étude. Les séquences ont été choisies pour permettre la quantification et la mesure des brins d'ARN comme brins simples, ou comme structures duplex correspondantes (aucune autre structure secondaire n'a été prédite thermodynamiquement stable). Le CD a été utilisé pour établir les paramètres structurels, c'est -à- dire la formation de duplex et les transitions de dénaturation thermique.
La synthèse
La procédure globale pour l'obtention de ces oligonucléotides est illustrée à la figure 1 et suit le processus par étapes: synthèse en phase solide automatisée → DeprOtection → Purification → Quantification → Caractérisation. La figure 2 affiche les unités monomériques qui sont nécessaires dans cette procédure. La synthèse en phase solide de l'ARN est similaire à celle de l'ADN en ce qu'elle est basée sur la chimie de la phosphoramidite ( figure 2 , à gauche) et l'utilisation de groupes protecteurs labiles-basiques pour les amines nucléophiles exocycliques sur G, A et C, par exemple , Acétyle, benzoyle, phénoxyacétyle, t- butyle ou N , N- diméthylformamide ( figure 2 , à droite). Un autre aspect à considérer dans l'ARN, en raison de la présence du groupe C2'-OH (dépourvu de biopolymères désoxyoligonucléotidiques), est l'étape supplémentaire qui doit être incorporée pour la protection et la déprotection subséquente de cette position nucléophile. À cet égard, les groupes protecteurs à base de silicium sont devenus une stratégie attrayante en raison de leur potentiel en tant que fragments biorthogonaux (en particulierEt déprotégé en présence de fluorure), avec les groupes tert – butyl -diméthylsilyle (TBDMS) et triisopropylsilyloxyméthyle (TOM) comme choix populaires ( figure 2 , en bas à gauche).
Dans ce travail, la synthèse automatisée a été réalisée sur un synthétiseur d'ADN / ARN qui utilise une chimie standard de phosphoramidite. Les paramètres du fabricant sur l'instrument incluent une étape de dilution automatisée lors de l'utilisation des versions commerciales des phosphoramidites pour l'ADN, ou l'option de dilution aux volumes définis par l'utilisateur. Cependant, nous avons décidé de peser le phosphoramidite d'ARN et de diluer manuellement, étant donné que: 1) le prix des phosphoramidites canoniques de l'ARN est plus élevé (jusqu'à 50 fois plus cher dans certains cas); 2) les phosphoramidites modifiés sont souvent obtenus en petites quantités; Et 3) la quantité de matière gaspillée lors de l'utilisation d'une étape de dilution automatisée (établie par le fabricant) est importante. En outre, nous avons utilisé: 1) supports solides disponibles dans le commerce(Par exemple , CPG) contenant une nucléobase protégée pour fonctionner comme extrémité 3 '; Et 2) phosphoramidites commerciaux (nucléobases canoniques) protégés avec un groupe TBDMS à la position C2'- O . La liste détaillée des étapes de synthèse est fournie sur la figure 3 et le tableau 1 , ainsi que d'autres descriptions et commentaires pour les étapes qui ont été ajustées pour la synthèse de l'ARN. En outre, la figure 4 illustre les rendements par étapes qui sont observés pour chaque étape après avoir sélectionné l'option 'Trityl Monitor', qui quantifie le cation trityl libéré de chaque étape de détritylation.
Il convient de noter que typiquement, selon notre expérience, le facteur limitant était l'obtention du phosphoramidite contenant la modification souhaitée. C'est-à-dire le développement d'une méthodologie synthétique qui permet d'incorporer des modifications sur certains sites. Dans ce rapport, nous nous concentrons surIncorporation d'un nucléotide modifié pour lequel nous avons établi la méthodologie synthétique correspondante, le groupe C2'- O- thiophénylméthyle. Ce groupe est de petite taille et n'affecte en rien la synthèse en phase solide. Comme l'incorporation de ce groupe dans des oligonucléotides d'ARN a été rapportée, ainsi que des paramètres structurels et thermodynamiques 4 , aucun aspect de la synthèse organique conduisant aux phosphoramidites modifiés ne sera décrit ici.
Déprotection, purification et caractérisation
La déprotection des amines exocycliques et des groupes ß-cyanoéthyle se produit dans la même étape que celle du clivage de la résine CPG. Nous avons appliqué les conditions couramment utilisées pour chauffer la résine obtenue en présence d'une solution aqueuse d'AMA, suivie d'un clivage des groupes C2'- O- silyle en présence d'ions fluorure, puis purification par gelÉlectrophorèse. Bien que ces conditions soient devenues des conditions standard dans de nombreux cas, des modifications qui sont labiles aux conditions basiques ou aux ions fluorure peuvent nécessiter des conditions plus douces 13 , 14 , par exemple , le méthanol / carbonate de potassium (MeOH / K 2 CO 3 ) ou la butylamine. Ainsi, un ensemble différent de groupes protecteurs sur les phosphoramidites correspondants est nécessaire. En outre, nous avons choisi l'électrophorèse comme alternative privilégiée pour purifier les oligomères déprotégés étant donné notre expérience antérieure avec cette méthode et le manque d'autres instruments. Cependant, la HPLC peut en variante être utilisée comme méthode efficace 15 . La caractérisation des oligonucleotides purifiés a été réalisée par spectrométrie de masse, désorption / ionisation laser assistée par matrice – temps de vol (MALDI-TOF), en utilisant une procédure rapportée par notre groupe 16 .
Caractérisation structurelle et ther La stabilité des duplex obtenus a été réalisée par CD. Plus précisément, nous utilisons CD pour déterminer les transitions de dénaturation thermique d'oligonucléotides modifiés et non modifiés d'ARN en suivant la diminution de l'ellipticité de la bande à env. 270 nm, ainsi que la disparition de la bande (avec ellipticité négative) avec un λ max à 210 nm. Une comparaison de spectres avant et après l'hybridation est fournie pour illustrer leurs différences et fournir une validation de la méthodologie employée. L'utilisation de CD est largement acceptée dans la détermination de motifs structuraux dans les acides nucléiques et les acides aminés 17 , et peut donc être utilisée comme outil pour déterminer différents paramètres structurels et thermodynamiques 18 ; Cependant, il n'y a pas beaucoup d'exemples où la technique est utilisée pour évaluer les transitions de dénaturation thermique. Certains cas comprennent la détermination des stabilités thermiques sur l'ADN contenant des quadruplexs GAss = "xref"> 19 , 20 ou dans les duplex et les épingles à cheveux de l'ARN 21 .
Ce rapport vise à fournir au lecteur ou au téléspectateur non expert un ensemble d'outils qui permettent un démarrage en douceur de ce type de recherche. Il servira à améliorer et à comparer avec les méthodologies et les techniques d'autres laboratoires de recherche impliqués dans cette branche de science intéressante. Le contenu de ce rapport ajoute aux protocoles existants de cette technologie à partir de diverses sources et enrichit et facilite l'expérience avec une aide visuelle pour chaque étape.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intention de ce manuscrit est de servir de guide aux chercheurs sur le terrain, débutant ou expert, pour réussir ou améliorer la synthèse d'oligonucléotides d'ADN ou d'ARN. La méthodologie décrite se concentre sur l'utilisation de la synthèse en phase solide en utilisant un synthétiseur d'ADN / ARN automatisé via une chimie standard de phosphoramidite. Le rapport décrit une description étape par étape de la synthèse, de la purification et de la caractérisation des dodecamères d&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La préparation de ce manuscrit a été soutenue par des fonds de démarrage de l'Université du Colorado Denver (JMRE). AF souhaite remercier un prix Research and Creative Activities (RaCAS, CU Denver). Le financement du Bureau des services de recherche, l'Université du Colorado Denver pour couvrir les frais de publication est reconnu. Nous aimerions remercier les membres de laboratoire Mme Cassandra Herbert et M. Yannick K. Dzowo pour leurs contributions dans la partie vidéo.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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