आरएनए के ओलिगोमर्स के ठोस चरण संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल जिसमें 2'-<em> हे</em> - थिफ़ेनिलमिथिल संशोधन और परिपत्र के माध्यम से परिपत्र दिब्रूवाद
Summary
यह लेख सी 2- ओ- रिप्लेसमेंट में संशोधित आरएनए के डोडेकमर्स के ठोस चरण संश्लेषण, शुद्धि और लक्षण वर्णन पर एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है। यूवी-विज़ और सर्कुलर डिचोरिजम फोटेट्रिक विश्लेषण का उपयोग स्ट्रक्चरल पहलुओं को मापने और चिह्नित करने के लिए किया जाता है, अर्थात् एकल स्ट्रैंड या डबल-स्ट्रैंड्स।
Abstract
ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग न्युक्लिक एसिड के कैनोनिकल और संशोधित पॉलिमर प्राप्त करने के लिए किया गया है, विशेष रूप से डीएनए या आरएनए, जिसने इसे विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों के लिए और विभिन्न शोध उद्देश्यों के लिए एक लोकप्रिय पद्धति बना दिया है। यहां वर्णित प्रक्रिया में आरएनए 5 '- [सीयूए सीजीजी एएयू सीएयू] -3' के संश्लेषण, शुद्धि और लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया गया है- सी 2 ' ओ- ओपीओशन' पर स्थित शून्य, एक या दो संशोधनों वाला जांच 2-थियोफिनेल्मिथेटिल समूहों पर आधारित होती है, जो मानक कार्बनिक संश्लेषण के माध्यम से आरएनए न्यूक्लियोटाइड्स में शामिल होते हैं और संबंधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में उनके संबंधित फॉस्फोरामिडाइट्स के माध्यम से पेश होते हैं। इस रिपोर्ट में चार विहित न्यूक्लियोबेस (uridine (यू), साइटोसिन (सी), guanosine (G), एडेनोसाइन (ए)), और साथ ही 2-thiophenylmethyl क्रियाशील न्यूक्लियोटाइड 2'- हे पर संशोधित के माध्यम से phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग करता है – पद; हालांकि, एक बड़े var के लिए कार्यप्रणाली योग्य हैवर्षों में विकसित किए गए संशोधनों की मीठी। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एक नियंत्रित-ताकना कांच (सीपीजी) समर्थन पर संश्लेषित किया गया, जिसके बाद मानक शर्तों के तहत राल और वंशानुक्रम से क्लेवेज किया गया, अर्थात् अमोनिया और मेथाइलामाइन (एएमए) का मिश्रण हाइड्रोजन फ्लोराइड / ट्राईथाइलैमाइन / एन-मेथिलपीरोलिडीनोन द्वारा पीछा किया गया। इसी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को पॉलिएक्लाइमाइड वैद्युतकणसंचलन (20% डेंटलिंग) के माध्यम से शुद्ध किया गया था, इसके बाद उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी (सेप-पीक, सी 18 -column) के माध्यम से अलौकिक, डिसलाटिंग और अलगाव किया गया था। क्रमशः और संरचनात्मक पैरामीटर को क्रमशः पराबैंगनी-दृश्य (यूवी-विज़) और सर्कुलर डिचोरिज्म (सीडी) फोटोटेट्रिक विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। इस रिपोर्ट का उद्देश्य इस क्षेत्र में शुरू करने वाले इच्छुक और विशेषज्ञ शोधकर्ताओं के लिए संसाधन और मार्गदर्शन के रूप में सेवा करना है। उम्मीद है कि नई प्रौद्योगिकियों और तरीकों के विकास के कार्य-प्रगति के रूप में कार्य करना होगा। थी के भीतर तरीकों और तकनीकों का विवरणएस दस्तावेज़ एक डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र (2013 में नवीनीकृत और खरीदा गया) के अनुरूप है जो फास्फोरैमिडीट रसायन विज्ञान का उपयोग करता है
Introduction
डीएनए / आरएनए के oligonucleotides प्राप्त करने के लिए ठोस चरण संश्लेषण एक शक्तिशाली उपकरण है, जो 1 9 2 के 1 , 2 , 3 के बाद से विभिन्न क्षेत्रों में फ़ॉस्फोरामिडाइट बिल्डिंग ब्लॉक 4 का उपयोग करते हुए कई अनुप्रयोगों का उपयोग किया है। इसके व्यापक प्रभाव के उदाहरणों में शामिल हैं: लेबलिंग (क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रियाओं के माध्यम से ) 5 , संरचनात्मक जांच 6 , और एंटीसेन्स टेक्नोलॉजीज 7 के साथ-साथ जैविक तंत्र 8 , 9 , अपनी जेनेटिक सामग्री 10 के स्रोत, और अध्ययन कई प्राकृतिक और / या रासायनिक संशोधनों 11 , 12 , कई अन्य लोगों के बीच में। संशोधन जो हम यहां उपयोग करते हैं वह आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स प्राप्त करने के हमारे प्रयासों में पहला कदम दर्शाता हैइस महत्वपूर्ण बायोपॉलिमर के संरचना और कार्य के अस्थायी नियंत्रण को सक्षम करने के लिए फोटोएक्टिव जांच
अनुक्रमों के साथ आरएनए डोडेकैमर्स के संश्लेषण: 5 '- [सीयूए सीजी जी ए एयू केयू] -3' / 5 '- [AUU AUU CCG UAG] -3' (रेखांकित पदों में एक सी 2 ' ओ- थिफ़ेनेमिलिथिल संशोधन का समावेश होता है ) इस अध्ययन के फोकस का गठन किया है। अनुक्रम को आरआईए किलों की मात्रा को मापने और एकल किस्में के रूप में मापने के लिए चुना गया था, या उनके संबंधित द्वैध संरचनाओं के रूप में (अन्य माध्यमिक संरचनाओं को थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर के रूप में नहीं बताया गया था)। सीडी का उपयोग स्ट्रक्चरल मापदंडों, यानी डुप्लेक्स गठन और थर्मल डिनटैचरेशन ट्रांज़िशन की स्थापना के लिए किया गया था।
संश्लेषण
इन oligonucleotides प्राप्त करने के लिए समग्र प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है और stepwise प्रक्रिया का पालन करती है: स्वचालित ठोस चरण संश्लेषण → Deprओटेक्शन → शुद्धि → मात्राकरण → विशेषता चित्रा 2 चित्रा 2 इस प्रक्रिया में आवश्यक है कि monomeric इकाइयों को प्रदर्शित करता है। आरएनए का ठोस चरण संश्लेषण डीएनए के समान है, जो कि फॉस्फोरैमिडीइट रसायन ( चित्रा 2 , बाएं) पर आधारित है और जी, ए और सी पर न्यूक्लियोफिलिक एक्सोक्लेक्लिक एमाइंस के लिए आधार-लैबिल रक्षा समूहों का उपयोग, जैसे , एसिटाइल, बैन्जॉयल, फेनोनैक्सीटिल, टी- ब्यूटी या एन , एन- डायमिथाइलफार्माइड ( चित्रा 2 , दाएं)। सी 2'-ओएच समूह (डीओकोनीओलिऑनियोलियोटइड बायोपॉलिमर्स में कमी) की उपस्थिति के कारण आरएनए में विचार करने के लिए एक और पहलू है, यह अतिरिक्त कदम है जिसे सुरक्षा के लिए शामिल किया जाना है, और बाद में इस न्यूक्लेओफिलिक स्थिति की deprotection। इस संबंध में, सिलिकॉन-आधारित सुरक्षा समूह एक आकर्षक रणनीति बन गए हैं क्योंकि जैवघटोगात्मक moieties (विशिष्ट सभीवाई फ्लोटोराइड की उपस्थिति में deprotected), टीआरटी -बल्टिडाइमथाइलसिलील (टीबीडीएमएस) और ट्राइज़ोप्रोपल्स्सिल्लोक्सीमाइथाइल (टॉम) समूहों के साथ लोकप्रिय विकल्प ( चित्रा 2 , नीचे-बाएं) के साथ।
इस काम में, स्वचालित संश्लेषण डीएनए / आरएनए सिंथेसाइज़र पर किया गया था जो मानक फॉस्फोरामिडाइट रसायन विज्ञान का उपयोग करता है। उपकरण पर निर्माता सेटिंग्स में डीएनए के लिए फॉस्फोरैमिडीइट के व्यावसायिक संस्करणों का उपयोग करते समय एक स्वचालित कमजोर पड़ने का चरण शामिल होता है, या उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मात्रा में कमजोर करने का विकल्प। हालांकि, हमने आरएनए फॉस्फोरैमिडिइट का वजन करने का निर्णय लिया और मैन्युअल रूप से इसे पतला किया: 1) आरएनए के कैनोनिकल फॉस्फोरामिडाइट्स की कीमत अधिक है (कुछ मामलों में 50 गुना अधिक महंगा); 2) संशोधित फॉस्फोरमिडिट्स अक्सर छोटी मात्रा में प्राप्त होती हैं; और 3) एक स्वचालित कमजोर पड़ने का कदम (निर्माता द्वारा निर्धारित) का उपयोग करने पर व्यर्थ सामग्री की मात्रा बड़ी है इसके अलावा, हमने इस्तेमाल किया: 1) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ठोस समर्थन( उदाहरण के लिए , सीपीजी) जिसमें 3-अंत के रूप में काम करने के लिए संरक्षित न्युक्लोबबेस होता है; और 2) वाणिज्यिक फॉस्फोरियमिडिट्स (कैनोनिकल न्यूक्लियोबासिस) को सी 2'- ओ- बिज़िशन में एक टीबीडीएमएस समूह के साथ संरक्षित किया गया है। संश्लेषण चरणों की विस्तृत सूची चित्रा 3 और तालिका 1 में प्रदान की गई है, साथ में अधिक विवरण और आरएनए संश्लेषण के लिए समायोजित चरणों के लिए टिप्पणियों के साथ। इसके अलावा, चित्रा 4 में 'ट्राइटिल मॉनिटर' विकल्प चुनने के बाद प्रत्येक चरण के लिए देखे जाने वाले चरण-योग्य उपज को दिखाया गया है, जो प्रत्येक डिट्रिटिएलेशन चरण से रिलीज किए गए ट्रैटल कथन का परिमाण करता है।
यह ध्यान देने योग्य है कि आम तौर पर, हमारे अनुभव में, सीमित कारक फ़ॉस्फोरामिडाइट प्राप्त कर रहा था जिसमें वांछित संशोधन होता था। यही है, एक सिंथेटिक पद्धति का विकास जो कि चयनित साइटों पर संशोधनों को शामिल करने की अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में, हम इस पर ध्यान देते हैंएक संशोधित न्यूक्लियोटाइड का समावेश जिसमें हमने इसी सिंथेटिक पद्धति को स्थापित किया है, सी 2'- ओ- थिफ़ेन्इलमैथाइल समूह। यह समूह आकार में छोटा है और किसी भी तरह से ठोस चरण संश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है। चूंकि इस समूह को आरएनए के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड में शामिल किया गया है, संरचनात्मक और थर्मोडायनामिक मापदंडों के साथ 4 , संशोधित फॉस्फोरमिडितों के लिए अग्रणी कार्बनिक संश्लेषण के कोई पहलू को यहां वर्णित नहीं किया जाएगा।
Deprotection, शुद्धिकरण, और विशेषता
एक्सोक्स्क्लिक एमाइंस और एसएएस-साइनोइथाइल समूहों की अवरोध सीपीजी-राल से दरार के समान ही होता है। हम एएमए के एक जलीय समाधान की उपस्थिति में प्राप्त राल को गर्म करने की सामान्यतः उपयोग की जाने वाली शर्तों को लागू करते हैं, फ्लोराइड आयनों की उपस्थिति में C2'- O -silyl समूहों के दरार के बाद, और फिर जेल के माध्यम से शुद्धिवैद्युतकणसंचलन। हालांकि ये कई मामलों में मानक स्थितियां बन गए हैं, मूलभूत स्थितियों या फ्लोराइड आयनों के लिए प्रयोगात्मक संशोधनों के लिए मामूली शर्तों 13 , 14 , उदाहरण के लिए , मेथनॉल / पोटेशियम कार्बोनेट (मेओएच / के 2 सीओ 3 ), या बायोलामाइन की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, संबंधित फॉस्फोरैमिडों पर रक्षा समूहों का एक अलग समूह आवश्यक है इसके अलावा, हमने इस पद्धति के साथ पिछले अनुभव को देखते हुए, deprotected oligomers को शुद्ध करने के लिए पसंदीदा विकल्प के रूप में वैद्युतकणसंचलन चुना और अन्य इंस्ट्रूमेंटेशन की कमी। हालांकि, एचपीएलसी वैकल्पिक रूप से प्रभावी विधि 15 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। शुद्ध समूह oligonucleotides की विशेषता जन स्पेक्ट्रोमेट्री, मैट्रिक्स सहायता लेजर desorption / ionization उड़ान के समय के माध्यम से किया गया था (MALDI-TOF), हमारे समूह 16 द्वारा एक रिपोर्ट की प्रक्रिया का उपयोग कर।
संरचनात्मक लक्षण वर्णन और प्राप्त डुप्लेक्स की खराब स्थायित्व सीडी के माध्यम से किया गया था। विशेष रूप से, हम आरएएन के संशोधित और अनअर्डेड ओलिगोनक्लियोटाइड्स के थर्मल विकृतीकरण संक्रमण को सीए पर बैंड की अण्डाकारता में कमी के बाद निर्धारित करने के लिए सीडी का उपयोग करते हैं। 270 एनएम, साथ ही बैंड के लापता होने (नकारात्मक अंडाकारता के साथ) 210 एनएम पर एक λ अधिकतम के साथ। संकरण से पहले और बाद में स्पेक्ट्रा की तुलना उनके मतभेदों को स्पष्ट करने और नियोजित कार्यप्रणाली की मान्यता प्रदान करने के लिए प्रदान की जाती है। सीडी के उपयोग व्यापक रूप से न्यूक्लिक एसिड में संरचनात्मक रूपांकनों के निर्धारण में स्वीकार किया जाता है और 17 aminoacids, और इसलिए विभिन्न संरचनात्मक और thermodynamic के मापदंडों 18 निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्यरत जा सकता है; हालांकि, ऐसे कई उदाहरण नहीं होते हैं जहां तकनीक का उपयोग थर्मल डिनट्राटेशन संक्रमण का आकलन करने के लिए किया जाता है। कुछ मामलों में जी-क्वाड्रैप्लेक्सिस युक्त डीएनए पर थर्मल स्थिरता के निर्धारण शामिल हैंAss = "xref"> 19 , 20 या आरएएनए 21 के डुप्लेक्स और हेयरपिन में
यह रिपोर्ट गैर-विशेषज्ञ रीडर या व्यूअर को ऐसे उपकरणों के सेट प्रदान करने का इरादा रखती है जो इस प्रकार के अनुसंधान के लिए एक सुचारू रूप से शुरुआत करते हैं। यह विज्ञान की इस रोमांचक शाखा में शामिल अन्य अनुसंधान प्रयोगशालाओं में तरीकों और तकनीकों के साथ बढ़ाने और उनकी तुलना करने के लिए काम करेगा। इस रिपोर्ट की सामग्री विभिन्न स्रोतों से इस तकनीक के मौजूदा प्रोटोकॉल को जोड़ती है, और प्रत्येक चरण के लिए दृश्य सहायता के साथ अनुभव को समृद्ध और सुविधाजनक बनाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि का इरादा डीएनए या आरएनए के oligonucleotides के संश्लेषण को सफलतापूर्वक प्राप्त करने या बढ़ाने के लिए क्षेत्र, शुरुआत या विशेषज्ञ में शोधकर्ताओं के लिए एक मार्गदर्शक के रूप में सेवा करना है। वर्णित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि की तैयारी कोलोराडो डेन्वेर विश्वविद्यालय (जेएमआरई) से शुरूआती निधि के माध्यम से समर्थित किया गया था। एएफ रिसर्च एंड क्रिएटिव एक्टिविटी पुरस्कार (आरईसीएएस, सीयू डेनवर) से समर्थन स्वीकार करना चाहेंगे। प्रकाशन शुल्क को कवर करने के लिए रिसर्च सर्विसेज, कोलोराडो डेन्वर विश्वविद्यालय के कार्यालय से फंडिंग स्वीकार है। हम वीडियो भाग में उनके योगदान के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों सुश्री कैसंद्रा हर्बर्ट और श्री यानीक के। डज़ोओ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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