Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2'-<em> O</em> -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare
Summary
Questo articolo fornisce una procedura dettagliata sulla sintesi a fase solida, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA modificati nella posizione C2'- O . Le analisi fotometriche UV-vis e dicroismo circolare sono utilizzate per quantificare e caratterizzare gli aspetti strutturali, cioè singoli fili o doppioni.
Abstract
La sintesi a fase solida è stata utilizzata per ottenere polimeri canonici e modificati di acidi nucleici, in particolare di DNA o RNA, che lo ha reso una metodologia popolare per applicazioni in vari settori e per scopi diversi di ricerca. La procedura qui descritta si concentra sulla sintesi, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contenenti zero, una o due modifiche situate alla posizione C2'- O . Le sonde sono basate sui gruppi 2-tiofenilmetilici, incorporati in nucleotidi RNA tramite la sintesi organica standard e introdotti nei corrispondenti oligonucleotidi attraverso i loro rispettivi fosforamiditi. Questo rapporto si avvale di fosforammidite chimica attraverso i quattro basi azotate canoniche (uridina (U), citosina (C), guanosina (G), l'adenosina (A)), nonché 2-thiophenylmethyl nucleotidi modificati funzionalizzati al 2'- O – posizione; Tuttavia, la metodologia è amenable per un grande varLe modifiche che sono state sviluppate nel corso degli anni. Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un supporto a vetrino controllato (CPG) seguito da scissione dalla resina e deprotezione in condizioni standard, vale a dire una miscela di ammoniaca e metilammina (AMA) seguita da idrogeno fluoruro / trietilammina / N-metilpirrolidinone. I corrispondenti oligonucleotidi sono stati purificati mediante elettroforesi in poliacrilammide (denaturazione del 20%) seguita da eluizione, disidratazione e isolamento mediante cromatografia a fase inversa (Sep-pak, C 18- colonna). Quantificazione e parametri strutturali sono stati valutati, rispettivamente, mediante l'analisi fotometrica a raggi ultravioletti (UV-vis) e circolare dichroismo (CD). Questo rapporto mira a servire come risorsa e guida per i principianti e per i ricercatori esperti interessati ad intraprendere questo settore. Si prevede di essere un lavoro in corso, in quanto si sviluppano nuove tecnologie e metodologie. La descrizione delle metodologie e delle tecniche in essoS corrispondono a un DNA / RNA sintetizzatore (rinnovato e acquistato nel 2013) che utilizza la chimica di fosforamidite.
Introduction
La sintesi in fase solida per ottenere gli oligonucleotidi del DNA / RNA è un potente strumento che ha servito parecchie applicazioni in vari campi sin dagli anni '70 1 , 2 , 3 usando i blocchi di costruzione di fosforamidite 4 . Esempi della sua vasta influenza includono: il suo impatto sull'etichettatura ( tramite reazioni di chimica clicca) 5 , la sonda strutturale 6 e le tecnologie antisenso 7 , nonché la sua spiegazione dei meccanismi biologici 8 , 9 , fonte di materiale genetico 10 e lo studio di Varie modificazioni naturali e / o chimiche 11 , 12 , tra molti altri. La modifica che usiamo qui rappresenta il primo passo nei nostri sforzi per ottenere oligonucleotidi RNA che contengonoSonde fotoattive per consentire il controllo temporale della struttura e della funzione di questo importante biopolimero.
La sintesi di RNA con sequenze dodecameri: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [agosto AUU CCG UAG] -3' (posizioni sottolineate rappresentano l'incorporazione di una modifica -thiophenylmethyl C2'- O ) Costituisce l'oggetto di questo studio. Le sequenze sono state scelte per consentire la quantificazione e la misurazione dei fili RNA come singoli fili, o come corrispondenti strutture duplex (nessuna altra struttura secondaria è stata predetta come stabile termodinamica). CD è stato utilizzato per stabilire i parametri strutturali, cioè la formazione di duplex e le transizioni di denaturazione termica.
Sintesi
La procedura complessiva per ottenere questi oligonucleotidi è illustrata nella figura 1 e segue il processo stepwise: Sintesi solida automatica → DeprOzione → purificazione → quantificazione → caratterizzazione. La Figura 2 mostra le unità monomeriche necessarie in questa procedura. La sintesi in fase solida di RNA è simile a quella del DNA che si basa su fosforammidito chimica (Figura 2, sinistra) e l'uso di gruppi protettivi di base-labile per le ammine esociclici nucleofile in G, A e C, ad esempio, Acetil, benzoile, fenossiacetil, t- butile o N , N- dimetilformamide ( figura 2 , a destra). Un altro aspetto da considerare in RNA, dovuto alla presenza del gruppo C2'-OH (che non presenta i biopolimeri deoxyoligonucleotidi), è la fase supplementare che deve essere incorporata per la protezione e la successiva deprotezione di questa posizione nucleofila. A questo proposito, i gruppi di protezione a base di silicio sono diventati una strategia attraente per il loro potenziale come parti biortogonali (specificamenteSi è deprotected in presenza di fluoruro), con gruppi di terz- butilidimetilsilil (TBDMS) e triisopropilsililossimetil (TOM) come scelte popolari ( Figura 2 , in basso a sinistra).
In questo lavoro, la sintesi automatizzata è stata effettuata su un sintetizzatore DNA / RNA che utilizza la chimica standard di fosforamidite. Le impostazioni del produttore sullo strumento includono una fase di diluizione automatica quando si utilizzano le versioni commerciali dei fosforamiditi per il DNA o l'opzione di diluire a volumi impostati dall'utente. Tuttavia, abbiamo deciso di pesare l'fosforamidite di RNA e diluire manualmente in quanto: 1) il prezzo delle fosforamiditi canoniche dell'RNA è maggiore (in alcuni casi fino a 50 volte più costoso); 2) i fosforamiditi modificati vengono spesso ottenuti in piccole quantità; E 3) la quantità di materiale sprecato dopo l'utilizzo di una fase di diluizione automatica (impostata dal produttore) è grande. Inoltre, abbiamo usato: 1) supporti solidi disponibili in commercio(Ad esempio , CPG) contenente una nucleobase protetta per funzionare come 3'-end; E 2) fosforamiditi commerciali (nucleobasi canonici) protetti con un gruppo TBDMS alla posizione C2'- O . L'elenco dettagliato delle fasi di sintesi è fornito in Figura 3 e Tabella 1 , insieme ad ulteriori descrizioni e commenti per i passi che sono stati regolati per la sintesi di RNA. Inoltre, la Figura 4 illustra le rese graduali osservate per ogni passo dopo aver selezionato l'opzione 'Trityl Monitor', che quantifica il tritio cation rilasciato da ogni fase di detritilazione.
Vale la pena notare che tipicamente, nella nostra esperienza, il fattore limitante stava ottenendo il fosforamidite contenente la modifica desiderata. Cioè lo sviluppo di una metodologia sintetica che consente l'inserimento di modifiche in siti selezionati. In questa relazione, ci concentriamo sulIncorporazione di un nucleotide modificato per il quale abbiamo stabilito la corrispondente metodologia sintetica, il gruppo C2'- O- tiofenilmetile. Questo gruppo è di taglia piccola e non influenza la sintesi a fase solida in alcun modo. Dal momento che è stata riportata l'incorporazione di questo gruppo in oligonucleotidi di RNA, insieme ai parametri strutturali e termodinamici 4 , non saranno descritti aspetti della sintesi organica che conduce alle modificate fosforamidite.
Deprotezione, depurazione e caratterizzazione
La deprotezione delle amine esociclici e dei gruppi ß-cianoetil si verifica nello stesso passo di quello della scissione della resina CPG. Abbiamo applicato le condizioni comunemente utilizzate per riscaldare la resina ottenuta in presenza di una soluzione acquosa di AMA, seguita dalla scissione dei gruppi C2'- O- sililici in presenza di ioni di fluoruro e quindi di purificazione mediante gelelettroforesi. Mentre questi sono diventati condizioni standard in molti casi, modifiche che sono labili a condizioni di base o ioni fluoruro può richiedere condizioni più blande 13, 14, ad esempio, carbonato di metanolo / potassio (MeOH / K 2 CO 3), o butilammina. Pertanto, è necessario un diverso insieme di gruppi protettivi sui corrispondenti fosforamiditi. Inoltre, abbiamo scelto l'elettroforesi come alternativa preferita per purificare gli oligomeri deprotected dato la nostra precedente esperienza con questo metodo e la mancanza di altre strumentazioni. Tuttavia, la HPLC può essere utilizzata alternativamente come un metodo efficace 15 . La caratterizzazione degli oligonucleotidi purificati è stata effettuata mediante spettrometria di massa, desorbimento / ionizzazione-tempo di volo (MALDI-TOF) assistita dalla matrice, utilizzando una procedura riportata dal nostro gruppo 16 .
Caratterizzazione strutturale e ther La stabilità stabile dei duplex ottenuti è stata effettuata tramite CD. In particolare, facciamo uso di CD per determinare le transizioni di denaturazione termica di oligonucleotidi modificati e non modificati di RNA seguendo la diminuzione dell'elettricità della banda a ca. 270 nm, come pure la scomparsa della banda (con ellitticità negativa) con un λ max a 210 nm. Un confronto di spettri prima e dopo l'ibridazione viene fornito per illustrare le loro differenze e fornire la convalida della metodologia impiegata. L'uso del CD è ampiamente accettato nella determinazione di motivi strutturali negli acidi nucleici e negli aminoacidi 17 e può quindi essere impiegato come strumento per determinare diversi parametri strutturali e termodinamici 18 ; Tuttavia, non esistono molti esempi in cui la tecnica viene utilizzata per valutare le transizioni di denaturazione termica. Alcuni casi includono la determinazione di stabilità termica su DNA contenente G-quadruplexesAss = "xref"> 19 , 20 o in duplex e hairpins di RNA 21 .
Questo rapporto intende fornire al lettore o al visualizzatore non esperti un insieme di strumenti che consentono un inizio regolare di questo tipo di ricerca. Sarà utile migliorare e confrontare con metodologie e tecniche in altri laboratori di ricerca che sono coinvolti in questo eccitante ramo della scienza. Il contenuto di questa relazione aggiunge i protocolli esistenti di questa tecnologia da varie fonti e arricchisce e facilita l'esperienza con un aiuto visivo per ogni passaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intento di questo manoscritto è quello di servire da guida ai ricercatori del campo, principianti o esperti, per raggiungere o migliorare la sintesi di oligonucleotidi di DNA o RNA. La metodologia descritta mette a fuoco sull'utilizzo di sintesi a fase solida utilizzando un sintetizzatore automatizzato DNA / RNA tramite la chimica standard di fosforamidite. Il rapporto descrive una rappresentazione passo-passo della sintesi, della purificazione e della caratterizzazione di dodecameri RNA. Inoltre, l'uso d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La preparazione di questo manoscritto è stata sostenuta attraverso fondi di start-up dell'Università del Colorado Denver (JMRE). AF desidera riconoscere il sostegno da un premio per la ricerca e la creazione di attività creative (RaCAS, CU Denver). Finanziamenti presso l'Ufficio dei servizi di ricerca, University of Colorado Denver per coprire le spese di pubblicazione è riconosciuto. Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio, Sig.ra Cassandra Herbert e Yannick K. Dzowo per i loro contributi nella porzione video.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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