Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test
Summary
Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.
Abstract
Poisson zèbre phénotypes mutants sont souvent incomplètement par ressuage, se manifestant uniquement chez certains mutants. Des phénotypes intéressants qui apparaissent de manière irrégulière peuvent être difficiles à étudier et peuvent mener à la confusion des résultats. Le protocole décrit ici est un paradigme de reproduction simple pour augmenter ou diminuer la pénétrance chez les mutants squelettique létale de poisson-zèbre. Parce que des mutants létaux ne peuvent être sélectivement directement, la stratégie de reproduction sélective classique des tests de descendance est employée. Cette méthode comprend également les protocoles pour Kompetitive allèle spécifique PCR (KASP) génotypage poisson zèbre et coloration larves de poisson zèbre cartilage et OS. Application de la stratégie d’élevage décrite ici peut augmenter la pénétrance d’un phénotype squelettique intéressant permettant des résultats plus reproductibles dans les applications en aval. En outre, diminuant la pénétrance mutante grâce à cette stratégie de reproduction sélective peut révéler les processus de développement qui nécessitent surtout la fonction du gène muté. Le squelette est considérée comme plus précisément ici, nous proposons que cette méthodologie sera utile pour toutes les lignées mutantes de poisson-zèbre.
Introduction
Le poisson-zèbre est un système puissant modèle pour comprendre le développement du squelette. Avec des souches mutantes de poisson-zèbre, les biologistes peuvent déchiffrer la fonction du gène au cours de la formation squelettique. Cependant, les phénotypes mutants squelette de poisson-zèbre peuvent présenter avec une pénétrance variable1,2,3,4 qui peut gêner les analyses génétiques et de développement. Le but de cette méthode est triple. Tout d’abord, générant zebrafish lignées mutantes qui produisent régulièrement des phénotypes sévères permet des études sur le développement en aval comme enregistrement Time-lapse5 et transplantation6. Ces sortes d’études peuvent être paralysés en essayant d’étudier les phénotypes qui seulement manifestent de façon incohérente. Deuxièmement, consanguinité zebrafish souches peut diminuer la variation génétique, favorisant ainsi la reproductibilité et la cohérence expérimentale. Par exemple, les analyses d’hybridation sur une souche consanguine sélectivement tous in situ peuvent réduire la variabilité confondant et renforcer les conclusions. En troisième lieu, générant des souches sévères et douces vous révélera toute la série phénotypique qui peut résulter d’une mutation particulière.
À première vue, un élevage sélectif de mutants létaux semble impossible. Comment une race pour la pénétrance lorsque les animaux sont marqués pour la sélection sont morts ? Heureusement, méthodes d’élevage sélectif de sélection familiale, spécifiquement les descendants essais, ont démontré l’efficacité dans l’élevage des programmes pour les nombreuses années7,8. Ces programmes sont principalement utilisés pour la reproduction sélective pour les caractères qui ne sont présentes que dans un sexe, comme la production de lait chez la vache ou la production d’oeufs chez les poules. Les mâles de ces espèces ne peuvent être marqués directement, mais leur progéniture est notés et une valeur est alors attribuée aux parents. Empruntant cette stratégie, le protocole présenté ici consiste à marquer la progéniture mutante fixe et teintée d’une paire de poisson-zèbre qui sont hétérozygotes pour un gène mutant d’intérêt. La pénétrance d’un phénotype dans la descendance mutante mortelle homozygote est attribuée aux parents lorsqu’ils décident quels individus vont produire la prochaine génération de la ligne. Nous constatons que cette méthode est un moyen efficace de déplacer une pénétrance in zebrafish mutants squelettique létale1.
Semblable à d’autres études, ce protocole de reproduction sélective prend en vertu de critères d’examen comme couvée, la survie de la progéniture, développement normal des embryons et sex-ratio9. Toutefois, ces facteurs sont tous considérés dans le contexte d’un fond de mutants dans le but de déplacer la pénétrance mutante. Par conséquent, ce protocole étend précédent paradigmes de reproduction sélective en proposant une méthode pour renforcer les analyses mutants du développement ainsi que pour accroître l’homogénéité de l’arrière-plan.
Ce protocole requiert une vaste génotypage, aussi est-il important de développer un protocole fiable et rapide de génotypage à l’avance. Il y a nombreux génotypage protocoles disponibles10,11, cependant, nous trouvons le KASP génotypage12,13,14 est plus rapide, plus efficace et plus fiable que les méthodes de coût issu des enzymes de restriction le clivage des séquences amplifiées10. Par conséquent, nous incluons un protocole KASP dans ce travail. En outre, nous concentrer sur les phénotypes mutants squelettiques dans le présent protocole et incluent une procédure pour une coloration modifiée de précédents protocoles15Alcian bleu/alizarine rouge.
La méthode décrite ici est une stratégie simple pour déplacer une pénétrance mutante mortelle vers le haut ou vers le bas. Alors que ce protocole met l’accent sur les phénotypes mutants squelettiques, nous pensons que ce sera une stratégie utile pour l’élevage de poisson-zèbre mutant toutes les lignes. En fait, l’utilité de cette stratégie de reproduction susceptible s’étend au-delà de poisson-zèbre. Nous prédisons que ce protocole peut être modifié pour décaler la pénétrance dans un large éventail d’organismes. Décalant pénétrance létale de tests de descendance peut aider à faire avancer l’état d’avancement d’un généticien du développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Élevage sélectif dévoile les subtilités de la fonction du gène
Déplacement des phénotypes mutants pour être plus ou moins graves par reproduction sélective est un moyen simple pour acquérir de nouvelles connaissances en fonction des gènes. En comparaison avec des méthodes normalisées de reproduction non sélectionnée, le protocole présenté ici peut donner une compréhension plus complète des phénotypes mutants. Plus précisément, en générant des souches qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Chuck Kimmel pour orientation, John Dowd pour aide à l’élaboration de cette stratégie de reproduction, Macie Walker pour son travail en perfectionnant la tache squelettique et Charline Walker et Bonnie Ullmann pour obtenir des conseils utiles de poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par DE024190 K99/R00 à JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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