方法論記事

左室肥大の誘導マウスにおける低侵襲の横大動脈狭窄のテクニック

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DOI：

10.3791/56231

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2017年9月25日

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1Institute of Veterinary Physiology and Zurich Center for Integrative Human Physiology (ZIHP), University of Zurich, 2Laboratoire d'Innovation Thérapeutique, UMR7200, Université de Strasbourg - CNRS, 3Department of Cardiology, Canton Hospital Lucerne

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、段階的に説明するマウスにおける低侵襲横大動脈狭窄 (TAC) の技術。挿管や一般的に使用される標準的な手順に必要な換気の除去、TAC の低侵襲手術を簡素化し、動物の負担を軽減します。

要約

マウスの横の大動脈狭窄 (TAC) は、心不全、心室の肥大 (LVH) とその進行を左オーバー ロードによる圧力の実験調査のため最もよく使用される手技のひとつです。報告された調査の大半は、この手順を実行して、挿管と厳しい、時間のかかるレンダリングし、動物に外科的負担に追加動物の換気。このプロトコルの目的は、挿管することがなく低侵襲の TAC の簡略化手法とマウスの換気を記述することです。技術の重要なステップは、死亡率は低い、LVH の誘導で高効率を達成するために強調されます。

男性の c57bl/6 マウス (10 週齢, 25-30 g, n = 60) ケタミン ・ キシラジンの混合物の腹腔内注射の麻酔をかけられました。自発的に呼吸動物 3-4 mm 上部部分の胸骨を次 6/0 絹糸結紮援助の目に通してのセグメントは大動脈弓の下を通過し、鈍化 27 ゲージ針を結んだ。動物の偽手術を受けた同じ手術の準備なく大動脈狭窄。LVH を誘導の手順の有効性は、心/体重比の大幅な増加によって立証されています。術後後 3、7、14、28 日でこの比率が得られた (n = 6-10 各グループと各時点)。私たちの技術を使用して、LVH は 28 日目から 7 日目から偽の動物と比較して TAC で観察されます。手術と後半 (28 日間) 死亡率がともに 1.7% で非常に低い。

結論としては、マウスにおける低侵襲の TAC の本のコスト効果の高い手法は非常に低い手術と術後の死亡率を運ぶ、LVH を誘導する効率が高い。それは手術の手順を簡素化し、動物の負担を軽減します。このプロトコルで説明する重要な手順に従うことによって簡単に実行できます。

概要

過去年にわたって心不全の研究で実施されている実行可能な動物モデル1。小動物モデル心不全の大動物モデルと比較して、多数の潜在的な利点があります。住宅とメンテナンス コストの削減の横にある小さな動物モデルはより少なく複雑な設備を必要な2のための多くの研究者にアクセス可能です。

マウスモデル心不全ラットのモデルと同じ利点の多くを提供しています。さらに減少住宅コスト3、マウス モデルの恩恵を関連するトランスジェニック、ノックアウト (KO) の系統の可用性。携帯型固有の誘導 KO や遺伝子組換え戦略の可能性はマウスに心不全の病態を研究し、新規化学療法3を識別しようとする非常に貴重なツールを確認します。

マウスの中の心不全モデルは現在4を使用、最初のロックマン5で記述された横大動脈狭窄 (TAC) は圧力の過負荷による左心室の肥大 (LVH)1を生成する推奨モデル,3。 このモデルの最大の利点は LVH2の階層を許可する能力、左室が TAC に対応改造が異なるマウス系統間で変数。特に、c57bl/6 マウスは他系統4,6,7では発生可能性があります TAC 後急速な左心室拡張を開発します。

TAC の原因で高血圧症の突然の発症を約 50% 量の増加 LV 2 週間以内に急速に変調 LVH4の開発を目指して、薬理学的または分子の介入のアクティビティを確認することができます。TAC によって重篤な高血圧症の急性の誘導は進歩的な左室肥大を再現して丁度と大動脈弁狭窄症または高血圧症の臨床で観察された改造します。それにもかかわらず、多くの研究者がこのモデルを使用して、識別し、心不全4における新たな治療標的を変更します。

マウスでタックを実行すると、LVH とその後心不全2を誘導するために使用される他の技術のために必要なより大きい外科の専門知識が必要です。ほとんどの著者は、挿、換気、動物2,8, この手順より厳しい、時間がかかるし、動物の手術の負担を追加してこの手順を実行します。いくつか捜査官だけは、手術9,10,11を簡単に参照を研究で低侵襲の TAC を使用しています。

このプロトコルの目的は、ステップバイ ステップを説明するプロシージャの重要な段階を強調表示、マウスにおける低侵襲横大動脈狭窄の簡易で使いやすいテクニックです。これらのキーの手順を実行このテクニックを簡単に実行できます 1 つ。

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プロトコル

男性 c57bl/6 j マウス (10 週間、25 ~ 30 g、n = 60)、このプロトコルで使用されます。動物は、農学部と高等教育と研究のフランスの省によって策定されたガイドラインに準拠して人道的なケアを受けるし、1986 年 11 月 24 日の欧州共同体理事会指令に従ってすべてのプロシージャを実行 (86/609/EEC) およびフランスの法律。プロトコルによって承認された、" 地域倫理委員会動物実験 CREMEAS " (#2016092816207606).

1 です手術に備えて

  1. 12/12 h ダーク/ライト サイクル (詳細資料の表を参照) のための食糧との標準的なケージで飼養施設到着後 1 週間のマウスを維持し、水の利用可能な 広告。自由.
  2. 操作の日にマウス個々 のケージ、麻酔導入前に数分動物に追加のストレスを避けるために。手術の前日すべて手術器具を滅菌します
    3. 。
  3. 腹腔内ベンゼン ケタミン (51.4 mg/kg) およびキシラジン (3.3 mg/kg) 食塩水で希釈し混合物の単回投与を注入 (0.9 %nacl).
  4. つま先リトリート反射の不在によって麻酔の深さを確認してください
    5. 。
  5. 首と動物の胸を市販のカミソリで剃るし、剃毛エリア 70% アルコールで消毒します
    6. 。
  6. 動物を配置するには、臥位きれいなコルク作業パッドと粘着テープで足を修正します
    7. 。

2。手術

  1. 無菌手技が手順全体で使用されます。自発的に呼吸で動物、胸骨 ( 図 1) を公開するために中間の胸にスープラ胸骨切痕から 11 刃ナイフで縦正中頸部切開 10 mm 以上を実行します
    2. 。
  2. Crile 木 4/0 モノフィラメント ポリプロピレン宿泊縫合針ホルダーを渡すことによって、甲状腺を撤回し、作業パッドをテープします
    3. 。
  3. 気管を明らかにするマイクロ手術用鉗子でにべもなくあらかじめ気管の筋肉を区切ります
    4. 。
  4. 優しく滑らかな先端スライド閉じた顎を持つマイクロ手術用鉗子の湾曲した気管上、胸骨の後ろにします
    5. 。
  5. によって慎重に滑らかな先端カーブタイプ顕微鏡鉗子の顎の開閉を実施済み気管の筋肉の下と、胸膜を離れて移動する胸骨の後ろに鈍的切離
    6. 。
  6. 滑らかな先端ストレート マイクロ手術鉗子で右スープラ鎖骨の筋肉を持ち、動物の優しく胸を引き出します
    7. 。
  7. は、胸骨下骨ニッパーの下の顎をスライドさせ、3-4 mm の上部の部分胸骨切開 ( 図 2) を実行します。左に向かって少しミニ胸骨の下の部分を直接します
    8. 。
  8. は、マイクロ手術針ホルダーを使用してミニ胸骨の両側に第 2 肋間スペースを 7/0 モノフィラメント ポリプロピレン宿泊縫合から内部に外を通過します。肋間と内部胸部血管または胸膜への損傷を避けるために肋骨胸骨角の近くに滞在します
    9. 。
  9. 両側 7/0 モノフィラメント宿泊ポリプロピレン縫合糸を使用して胸骨端を広げるし、粘着テープで作業台に固定します
    10. 。
  10. ゆっくりの移動は、さておきあらかじめ気管筋、縦隔脂肪と低倍率 (2-3 X) 下大動脈弓を可視化する顕微鏡下に鉗子胸腺が滑らかな先端を使用して ( 図 3)。触れたり気胸の開発を防ぐために壁側胸膜を損傷しないよう注意します
    11. 。
  11. は、鉗子 ( 図 4 A) を結ぶことによって大動脈のアーチの下の軟部組織を公開し、その顎を優しく 。優しく軟部組織の中の顎の開閉により 2 番目の抱き合わせ鉗子で大動脈のアーチの下の軟部組織にトンネルを準備します
    12. 。
  12. は、大動脈弓の下で左の手にて結紮援助 ( 図 4 B) の目に通して 6/0 絹糸を結紮のセグメントを渡すし、鉗子の起源の間右手で開催を結ぶことによってそれを取得右の腕、左総頚動脈 ( 図 5).
  13. は 27 ゲージの針を 5 mm の長さにカット、Crile 針ホルダーとそれらを押すことによって両端を鈍らせます。滑らかな先端ストレート マイクロ手術鉗子で大動脈弓 ( 図 6) の横にある鈍い 27 ゲージ針を置き、針と右腕と左総頸動脈の間に大動脈の周りにぴったりと縫合糸を結ぶ( 図 7) 2 つの抱き合わせ鉗子を用いた動脈。ぴったりと縫合糸を結ぶ、4 つ追加ノットに続いて初期の二重結び目を実行します。すべての結び目がフラットであることを確認してください
    14. 。
  14. , 退院後すぐにでもやさしく 0.4 mm 径の狭小化を達成するために針と削除再現横 65-70% 大動脈狭窄
    15. 。
  15. は、胸骨端とあらかじめ気管の筋肉、大動脈弓周囲軟部組織の止血を確認します。吸収性止血ガーゼを入れてどこに血の滲みが観察されます。7/0 モノフィラメントポリプロピレン滞在胸骨端を広めるために使用される縫合糸削除します
    16. 。
  16. は左第 2 肋間スペースの中に外からマイクロ手術針ホルダーに簡単な 6/0 モノフィラメント ポリプロピレン縫合を通過し、内部から右側第 2 肋間スペースの外に、です。肋間と内部胸部血管または胸膜への損傷を避けるために肋骨胸骨角の近くに滞在します
    17. 。
  17. エッジをもたらす一緒に胸骨 Crile 木 6/0 モノフィラメント ポリプロピレン縫合糸を結ぶことによって針ホルダー
    18. 。
  18. 針ホルダー Crile 木と 1 つの層で縫合を実行 5/0 モノフィラメントポリプロピレンと皮膚を閉じます
    19. 。
  19. 同一の偽の手順を実行大動脈周囲縫合糸を結ぶことがなく、収縮操作します
    20. 。

3。手術後の回復

  1. 動物を非常に密接に監視します個々 のケージにマウスを移動し、腹臥位。
    2. 。
  2. 許可まで完全に温暖化の光の下で回復するマウス覚醒 (麻酔を誘導した後 1 h 未満).
  3. 術後鎮痛に対するブプレノルフィン 0.1 mg/kg を腹腔内注入します示されるように最初の 3 日のブプレノルフィンすべての 8 h の 0.1 mg/kg の皮下注射を繰り返します。
    4. 。
  4. 標準ケージ (檻あたり最大 3 マウス) とケージあたり最低 2 マウス操作マウスを配置します
    5. 。

4。心の収穫

  1. 分析の日、ケタミンの溶液でマウスを安楽死させる 300 mg/kg とキシラジン 20 mg/kg 腹腔内投与による生理食塩水中で
    2. 。
  2. 下大静脈から血液をまず収穫し、同じラインを生理食塩水で 2.6 mm EDTA 溶液 5 mL を注入します
    3. 。
  3. 心を収穫、心房を削除および重量の心臓 (心房なし左と右心室).
  4. は右の ventr から左側を分離します。残りの左心室部分に隔壁を持つ icle。両方の組織のサンプルの重量を量るし、液体窒素で凍結します
    5. 。

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結果

手術と後半の生存
手術の生存率は非常に高かった (TAC と sham 動物) シリーズ全体の 98.3% (59 のうち 60)。のみ手術死はかんな偽操作のマウスで出血合併症が原因でした。28 日の観察期間中に術後生存率もすばらしい, 98.3% (59 のうち 58) だった後半のみ術後死は心臓由来の可能性がある日 (D) 16、TAC マウスで発生しました。

技術の検証
紹介したテクニックは、非常に信頼性が高く、再現性の高いです。TAC を受けているすべての動物の組織の収穫時期に、右の腕、左総頚動脈間の縫合の正しい配置を確認しました。

心重量/体重比 (HW/BW、mg/g) 3、7、14、28 日後手術での決定によって左心室肥大を誘導する手法の有...

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ディスカッション

このプロトコルの目的は、マウスにおける低侵襲の横方向の大動脈狭窄に対する手技の順を追って図を提示することです。マウスで横方向の大動脈狭窄の詳細な技術的な説明は、他の著者2,8によって報告されています。ただし、これらの調査官は、手術を行う次の挿管や動物の換気。挿管換気の追加手順の使用が増加の複雑さと全体のプロシージャの持続期間および動物の世界のストレスにさらされています。これらの理由から、低侵襲の横方向の大動脈狭窄の概念は、いくつかの注目を受けています。マウスにおける低侵襲横大動脈狭窄、左心室肥大と心不全9,10,11にその進行を誘導するために使用されます。これらの研究は、手術手技9,10,

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開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

この仕事にしたスイスの心血管系財団の助成金 (N ° 32016) 支えられ

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
手術顕微鏡オリンパスSZX2-TR30
カミソリロウェンタノマド TN3650FO
<ストロング>縫合糸:
ポリプロピレン 7/0エチコンBV-1X
ポリプロピレン 6/0BBraunC0862061
シルク 6/0 結紮糸 FST18020-60
ポリプロピレン 4/0Ethicon8683
ポリプロピレン 5/0EthiconZ303
Drugs:
KetaminMerialImalgène 1000、LBM154AD
キシラジンバイエルロンプン2%、KP09PPC
ブプレノルフィンセバ獣医、072013
<ストロング>楽器: 
ボーンニッパー細かい手術用具16101-10
結紮補助具 細かい手術用具18062-12
抱き合わせ鉗子細かい手術用具18026-10
ニードルホルダー Crile-Wood細かい手術用具12003-15
マイクロサージェリー用鉗子 Fine Surgical Tools11003-12
マイクロサージェリー鉗子 ファインサージカルツール11002-12
組織鉗子ファインサージカルツール11021-12
マイクロサージェリー ニードルホルダーファインサージカルツール12076-12
マイクロサージェリーハサミファインサージカルツール91501-09
メイヨーハサミファインサージカルツール14511-15
11枚刃ナイフファインサージカルツール10011-00
RNA 抽出と qPCR:
TriReagentEuromedexTR-118-200
Rneasy Mini kitQiagen74704
Qubit Fluorimetric RNA assayFisher Scientific10034622
RNA 6000 Nano kitAgilent5067-1511
大容量cDNAキットフィッシャーサイエンティフィック10400745
タクマンマスターミックスフィッシャーサイエンティフィック10157154
タクマンBNPプライマーフィッシャーサイエンティフィックMm01255770_g1
タクマンANPプライマーフィッシャーサイエンティフィックMm01255747_g1 
Taqman ACEプライマーFisher ScientificMm00802048_m1
Taqman Col1a1プライマー フィッシャーサイエンティフィックMm00801666_g1
タクマンTGFbプライマーフィッシャーサイエンティフィックMm01178820_m1
タクマンガプドプライマーフィッシャーサイエンティフィックMm99999915_g1
ABIPrism サーモサイクラーApplied Biosystems7000
ソフトウェア:
GraphPad PrismGraphPadPrism 7
動物性食品
成体ラット/マウスのための完全食SafeUB220610R

参考文献

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