संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में सूक्ष्मजीवों के धारावाहिक Ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक विधि
Summary
इस अध्ययन के प्रसारण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में महंगे उपकरणों के बिना एक सूक्ष्मजीव के धारावाहिक ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय और आसान प्रक्रिया प्रस्तुत करता है ।
Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में उच्च आवर्धन पर तीन आयामों में कोशिकाओं और कोशिका घटकों अवलोकन नमूना के धारावाहिक ultrathin वर्गों की तैयारी की आवश्यकता है । हालांकि धारावाहिक ultrathin वर्गों की तैयारी के लिए बहुत मुश्किल माना जाता है, यह बजाय आसान है अगर उचित विधि का प्रयोग किया जाता है । इस पत्र में, हम सुरक्षित रूप से सूक्ष्मजीवों के धारावाहिक ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रिया दिखाते हैं । इस विधि के प्रमुख बिंदु हैं: 1) नमूना के बड़े हिस्से का उपयोग करने के लिए और नमूना सतह और चाकू किनारे को समायोजित करें ताकि वे एक दूसरे के समानांतर हैं; 2) समूहों में धारावाहिक वर्गों में कटौती और भट्ठा ग्रिड पर धारावाहिक वर्गों के एक समूह को वापस लाने जब बाल किस्में की एक जोड़ी का उपयोग कर वर्गों को अलग करने में कठिनाई से बचने के लिए; 3) एक ‘ अनुभाग होल्डिंग पाश ‘ का उपयोग करने के लिए और अनुभाग समूहों के आदेश मिश्रण से बचने के लिए; 4) एक ‘ पानी की सतह स्थापना पाश ‘ का उपयोग करने के लिए और वर्गों पानी के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं और सुनिश्चित करें कि वे ग्रिड पर वांछित स्थिति में उन्हें जगह के लिए, सबसे पहले, क्रम में उन्हें छूने; 5) एक एल्यूमीनियम रैक पर समर्थन फिल्म का उपयोग करें और यह आसान ग्रिड पर वर्गों को ठीक करने के लिए और समर्थन फिल्म के wrinkling से बचने के लिए बनाने के लिए; और 6) एक धुंधला ट्यूब का उपयोग करें और गलती से चिमटी के साथ समर्थन फिल्मों को तोड़ने से बचने के लिए । इस नई विधि मुश्किल के बिना धारावाहिक ultrathin वर्गों प्राप्त करने में सक्षम बनाता है । विधि यह 3 डी में उच्च संकल्प पर सूक्ष्मजीवों के सेल संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाता है, जो स्वत: टेप का संग्रह ultramicrotome विधि और सीरियल ब्लॉक-चेहरा या केंद्रित आयन बीम का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जा सकता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग ।
Introduction
उचित धारावाहिक ultrathin सेक्शनिंग तकनीक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर तीन आयामी कोशिकाओं और कोशिका घटकों का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य है. हम खमीर कोशिकाओं के सेल चक्र में धुरी ध्रुव शरीर की गतिशीलता का अध्ययन किया है, और सेल चक्र के दौरान उनके ultrastructure के रूपात्मक परिवर्तन का पता चला और दोहराव के समय1,2,3, 4,5. २००६ में, हम ‘ संरचना ‘ और ‘-ome ‘ के संयोजन से एक नया शब्द ‘ structome ‘ गढ़ा, और यह ‘ मात्रात्मक और तीन आयामी इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर एक पूरे सेल के संरचनात्मक जानकारी के रूप में परिभाषित ‘ 6,7.
द्वारा structome विश्लेषण, जो धारावाहिक ultrathin खंड तकनीक की आवश्यकता है, यह पाया गया कि Saccharomyces cerevisiae और Exophiala dermatitidis के एक खमीर सेल के बारे में २००,००० ribosomes7,8था, एक ई कोलाई सेल था २६,००० ribosomes9, एक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक सेल था १,७०० ribosomes10 और Myojin सर्पिल बैक्टीरिया था केवल ३०० ribosomes11। यह जानकारी न केवल प्रत्येक जीव में वृद्धि दर का आकलन करने में उपयोगी है, बल्कि प्रजातियों की पहचान में भी9.
इसके अलावा, structome विश्लेषण एक नए जीव की खोज के लिए नेतृत्व किया; Parakaryon myojinensis जापान, जिसकी कोशिका संरचना prokaryotes और eukaryotes12,13,14,15के उन लोगों के बीच एक मध्यवर्ती थे के तट से गहरे समुद्र में पाया गया । वर्तमान में सीरियल ultrathin सेक्शनिंग तकनीक को इतना कठिन माना जाता है कि इसमें महारत हासिल करने में काफी समय लगेगा । इस अध्ययन में, हमने एक विश्वसनीय विधि विकसित की है जिसमें कोई भी व्यक्ति बिना कठिनाई के धारावाहिक ultrathin का प्रदर्शन कर सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि यहां प्रस्तुत कोई महंगा उपकरण की आवश्यकता है । यह केवल एक एल्यूमीनियम रैक (चित्रा 3) की आवश्यकता है, तीन भट्ठा ग्रिड (चित्रा 6c), खंड-होल्डिंग छोरों (चित्रा 10a), पानी की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ईमानदारी से अपने बहुमूल्य सुझाव और चर्चा के लिए Shigeo Kita धंयवाद । हम भी धंयवाद जॉन और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सुमिरे Eckstein ।
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
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