ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス イメージングと脳スライス。さらに、無染色のミエリンを可視化するための簡単な手順が表示されます。
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方法論記事
可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング
この記事について
サマリー
要約
神経細胞は、電気絶縁性およびミエリンオリゴデンドロ サイトの栄養サポートに依存します。オリゴデンドロ サイトの重要性にもかかわらず現在ニューロンを研究に使用する高度なツール部分的にしか撮影されているオリゴデンドロ サイトの研究者。セル型固有のウイルスの伝達による染色は、ライブ オルガネラ動態を研究するための有用なアプローチです。本稿での転写の制御の下で対象となるミトコンドリアの蛍光蛋白質遺伝子を運んでいるアデノ随伴ウイルス (AAV) の伝達によって脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを可視化するためのプロトコルミエリン塩基性タンパク質のプロモーター。コロナ マウス脳切片切片を作るためのプロトコルが含まれています。[ミトコンドリアのタイムラプス イメージングのための手順に従います。これらのメソッドは、他の細胞器官に転送することができ、特に髄鞘の細胞小器官を調べる場合に役立ちますがあります。最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) による生活のスライスで無染色のミエリンの可視化を容易に利用できる手法について述べる。コアは、余分な機器を必要としないとライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。
概要
脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。
生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲッ....
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プロトコル
ここで説明する手順は、ノルウェーの動物研究の権威によって承認されています。サプライヤーおよび消耗品等のカタログ番号必要な機器が、ドキュメントの最後に材料のリストで利用できる
。1。 切片スライス準備
注: このレシピ使用 2 つのマウスの子犬生後 7-9 (p7-9)、2 つの六つの文化料理に分かれて 24 切片スライスをもたらす。無菌フードで特に記述がない限り、すべての手順を行う必要があり、nitril またはラテックスの手袋を使用する必要があります。細胞培養グレードの材料のみを使用する必要があります
。- オートクレーブ ボトル、解剖ツール (1 鉗子、1 の小さな丸いと尖ったスパチュラ 1 大きい平らなヘラ 1 小さなはさみ 1 大規模なシザーは、マテリアルを参照してください詳細についてはリスト)、ガラス ピペット、ピペット チップ、スライスの準備のために使用される組織綿 。
- ガラス ピペットの半分は、大きな開口部を使用する必要があります、狭い端を断つ。
- ダイヤモンド スクライバーとスコアはピペット ガラスが縮小を開始ポイントのすぐ下周り (ある場合) をペンします。ニトリル手袋にまたは類似した、ピペットの先のとがった端を置きます。慎重に作業台を押しながらピペットを曲げることによって先端を断つ 。
- 、砂紙....
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結果
脊髄脳スライス培養され、上記のように導入は、mito_dsred と GFP を表現する皮質のオリゴデンドロ サイトの疎な分布を示した。Olig2 および MBP 抗体で免疫染色式がオリゴデンドロ サイト (図 1) に固有であることを確認しました。
ライブ イメージングのため導入されたオリゴデンドロ サイトは並行 (図 1および図 2 a) を実行しているいくつかのミエリン鞘の彼らの特徴的な形態によって認識されました。導入されたオリゴデンドロ サイトのタイムラプス イメージングを実行すると、プライマリ プロセスとミエリン鞘 (図 2 b-D) 内のミトコンドリアの動きを監視すること.......
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ディスカッション
ここで説明した切片の文化を作るためのプロトコルは・ デ ・ シモーニと優 (2006 年)5で記述されたプロトコルの修正版18です。最も重要な変更は、以下に概説されています。Tris バッファーは、ウイルス伝達の間にインキュベーター外スライスの生存率と細胞培地の変更を向上させる文化メディアに追加されます。紙吹雪の殺菌のプロシージャも変更されます。他のプロトコルは、オートクレーブに入れることによって紙吹雪を殺菌しながらお勧めしませんこのカールに紙吹雪のいくつかを引き起こすので。これらの成長のスライスは健康ではないがちとカールの紙吹雪を使用しないでください。私たちプロトコル マウスを使用して、ないラット、および海馬ではなく野の文化へ変更我々 を見つけるは薄くスライス (230 μ m 対 300 μ m) で十分に働きます。生後から作られたマウスおよびラット19文化 10-20 周辺髄鞘形成のピークとしてマウス p7 9 (と、11-14 日の培養)、ミエリンオリゴデンドロ サイトを勉強して最適です.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
リンダ ヒルデガルト Bergersen とアクセス用 Magnar Bjørås 細胞研究室と装置、プラスミドのウイルス産生 Janelia 分子生物学共有リソース スタッフ、レーザー パワー測定について公園 Vervaeke に感謝しますノルウェーの健康協会、ノルウェーの研究評議会によって資金が供給されたこの作品、顕微鏡装置 Norbrain によって資金を供給されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロース | シグマ | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | 浴室および出口に使用される針 |
| AGA | 105701 | ||
| ブランドのピペット電球 | Sigma-Aldrich | Z615927 | ピペット電球 |
| ブンゼンバーナー(液体プロパンバーナー) | VWR | 89038-530 | |
| ヒーターコントローラー用ケーブルアセンブリ | ワーナーインスツルメンツ | 〒64-0106 | 温度調節器 - 温度計部品 |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 インキュベーター用 |
| カバーガラス、正方形 コーニング | サーモ Fischer Scientific | 13206778 | ライブイメージング用の浴槽下に取り付けます。接着剤またはワセリンゼリーで密封します。 |
| D-(+)-グルコース | シグマ | G7021 | |
| デリケートな鉗子 | ファインサイエンス | 11063-07 | 解剖用 |
| ダイヤモンドスクライバーペン | テッド・ペラ社 | 54463 | |
| 使い捨てガラス パスツールピペット 230 mm | VWR | 612-1702 | ガラスピペット |
| 両刃ステンレス鋼 カミソリ刃 | 電子顕微鏡科学 | #7200 | ビブラトーム用カミソリ刃 |
| アールズバランス塩溶液 (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| 濾紙サークル | シュライヒャー &Schuell | 300,220 | PFAのろ過に使用される濾紙 |
| ファンタック | ロックタイト | 1270884 | バスのインとアウトレットの位置を接続/調整するために使用 |
| ハンドタオル Cフォールド 2 | カトリン | 344388 | |
| ハープ、RC-41チャンバー用フラット | ワーナーインスツルメンツ | 64-1418 | お風呂で紙吹雪を押さえるハープ。オルガノタイプスライスで使用する前に、ひもを切り取ります。1.5 mm、13mm、SHD-41/15 |
| HEPES、FW:260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir、モデル1.2 | Heto-Holten | 96004000M | 層流フード |
| 血清、熱不活性化 | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCRメンブレン、PTFE、 | ミリポア | FHLC0130 | コンフェッティ |
| ライカ VT1200 | ライカ | 14048142065 | ビブラトーム |
| MEM-グルタマックス with HEPES | サーモ Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| マイクロスプーン Heyman Type B | 電子顕微鏡 Sciences | 62411-B | 解剖用の先端が鋭利な小型の丸みを帯びたスパチュラ |
| Millex-GPフィルターユニット | Millipore | SLGPM33RA | シリンジフィルターユニット |
| ミリセル細胞培養インサート、30 mm | ミリポア | PICM03050 | 細胞培養インサート |
| Minipuls 3 速度制御モジュール | GILSON | F155001 | ライブイメージング用蠕動ポンプ - 制御モジュール部 (2 カネルヘッドに接続) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo フィッシャーサイエンティフィ | 140675 | 培養プレート |
| ナイスタチン懸濁液 | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | ツァイス | 441452-9900-000 | ライブイメージングに使用される水浸対物レンズ。(WD=2.5mm)、VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| パラホルムアルデヒド、粒状 | 電子顕微鏡 Sciences | #19208 | |
| PC-R 灌流チャンバー | SiSkiYou | 15280000E | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン、液体 | Invitrogen | 15070-063 | |
| シャーレ 140 mm | ヘー | ガー1075 | 大型シャーレ |
| シャーレ 92x16 mm | ザルシュテット | 82.1473 | ミディアムシャーレ |
| ペトリディッシュ 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | 小型ペトリ皿 |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | シグマ | P4417 | PBS 錠剤 |
| R2 2 チャネル ヘッド | ギルソン | F117800 | ライブイメージング用蠕動ポンプ - 2チャンネルヘッド部(制御モジュールが必要) |
| ラウンド/フラットスパチュラス、ステンレススチール | VWR | 82027-528 | 解剖用大型スパチュラ |
| サンドペーパー | VWR | MMMA63119 | オプションで、割れたガラスのピペットを滑らかにするための |
| さみ, 17,5 cm | ファインサイエンス | 14130-17 | 解剖用大型はさみ |
| はさみ、8,5 | ファインサイエンス | 14084-08 | 小さくて鋭いはさみ for 解剖 |
| シングルエッジ、宝石ブレード | 電子顕微鏡科学 | #71972 | シングルエッジカミソリブレード |
| シングルインライン溶液ヒーター SH-27B | ワーナーインスツルメンツ | 64-0102 | 温度コントローラー - ヒーター部 |
| Steritop-GP フィルターユニット、500 ml、45mm | ミリポア | SCGPT05RE | 滅菌するフィルターソリューション |
| :瞬間接着剤、精密 | 、ロックタイト | 、1577386 | |
| 外科用メスブレード、No.22 | Swann Morton Ltd. | 209 | 丸みを帯びたメスの刃 |
| 温度調節器 TC324B | ワーナー・インスツルメンツ | 64-0100 | ライブイメージング用温度調節器(溶液ヒーターとケーブルアセンブリが必要) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | シグマ | T3253 | |
| ウォータージャケットインキュベーターシリーズII | フォーマサイエンティフィック | 78653-2882 | インキュベーター |
参考文献
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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再版と許可
