Este artículo describe un protocolo para la detección de uno o más de plasma y proteínas de la membrana intracelular mediante microscopía de superresolución estado agotamiento (GSD) en células de mamíferos. Aquí, discutimos las ventajas y consideraciones del uso de estos enfoques para la visualización y cuantificación de proteínas celulares.
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Artículo de método
La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos
En este artículo
Resumen
Resumen
Avances en biología celular y microscopía fluorescente se correlacionan íntimamente con la mayor habilidad de visualizar eventos celulares conduce a menudo a dramáticos saltos en nuestra comprensión de cómo las células de función. El desarrollo y la disponibilidad de la microscopía de superresolución ha ampliado considerablemente los límites de la resolución óptica de ~ 250-20 nm. Biólogos no se limitan a describir las interacciones moleculares en términos de colocalización dentro de un área de difracción limitada, más bien ahora es posible visualizar las interacciones dinámicas de las moléculas individuales. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de proteínas celulares por microscopia de agotamiento de la tierra-estado para la proyección de imagen fija de la célula. Proporcionamos ejemplos de dos proteínas de membrana diferentes, un elemento de la translocon del retículo endoplásmico, sec61β y un localizado en membrana del plasma voltaje tipo L de Ca2 + canal (CaV1.2). Discutidos son el microscopio específicos parámetros, métodos de fijación, cambio de foto formulación del buffer y trampas y desafíos de procesamiento de imágenes.
Introducción
Reacciones de señalización celulares traducen cambiando los entornos internos y externos para iniciar una respuesta celular. Regulan todos los aspectos de la fisiología humana, sirviendo como la Fundación de hormonas y liberación de neurotransmisor, del latido del corazón, visión, fertilización y función cognitiva. La interrupción de estas cascadas de señales puede tener consecuencias graves en forma de condiciones fisiopatológicas, incluyendo cáncer, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Durante décadas, los investigadores biológicos y médicos han utilizado con éxito proteínas fluorescentes, sondas y biosensores juntados con microscopía de fluorescenc....
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Protocolo
1. cubreobjetos de vidrio lavado
- el día antes de procesamiento de las muestras, limpiar #1.5 vidrio cubreobjetos por sonicando en una solución de 1 M de KOH para 1 h. Esto elimina cualquier contaminante fluorescente que puede estar presente en el cubre-objetos.
- El KOH del cubreobjetos con agua desionizada enjuague a fondo.
- Una vez limpiado en KOH, almacenar el cubreobjetos en etanol al 70% hasta que esté listo para uso.
2. Cubreobjetos de vidrio de capa
Nota: los pasos de esta sección deben realizarse en una campana de cultivo celular para prevenir....
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Resultados
Como se indica en la introducción, hay muchos microscopía de resolución súper diferentes modalidades de la proyección de imagen. Este protocolo se centra en la proyección de imagen de súper-resolución GSD. Imágenes representativas y localización mapas se muestran en la figura 2 y figura 3.
La figura 2 muestra una células COS-7 transfectadas.......
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Discusión
La reciente explosión de las tecnologías que permiten la proyección de imagen más allá del límite de difracción han ofrecido nuevas ventanas en las complejidades de células de mamífero en el espacio y el tiempo. Estas tecnologías incluyen tormenta STED, Palma, GSD, SIM y sus variantes (p. ej., dSTORM, FPALM). El ingenio de los científicos detrás de estas técnicas nos ha permitido sortear las limitaciones impuestas por las leyes de la física que rigen la difracción de la luz. A pesar de este enorme logro, cada un.......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención de la AHA para R.E.D. (15SDG25560035). Autores desean reconocer el Dr. Fernando Santana para el uso de su microscopio 3D de Leica SR GSD y el Dr. Johannes Hell por proporcionar amablemente el anticuerpo de la FP1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | Para limpiar cubreobjetos |
| #1.5 cubreobjetos 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | Para cultivar/procesar/obtener imágenes de células |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Diluir a 1x con agua desionizada |
| Poly-L-Lisine | Sigma | P4832 | Ayuda con la adhesión de las células a la laminina |
| de vidrio de recubrimientoSigma | 114956-81-9 | Ayuda a la adhesión celular al vidrio de recubrimiento | |
| Medio 199 | Thermo Scientific | 11150-059 Medios de | cultivo de miocitos ventriculares |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Medios de cultivo celular |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media suplemento |
| Penicilina/estreptomicina | Sigma | P4333 | Media suplemento |
| 0,05% tripsina-EDTA | Corning | 25-052-CL | Solución de cultivo celular |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reactivo de transfección transitoria |
| PBS libre de Ca2+ | Gibco | 1419-144 | Cultivo celular |
| 100 % Metanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Fijación celular |
| Paraformaldehído | Electrón Ciencias de la Microscopía | 15710 | Fijación |
| Celular Glutaraldehído | Sigma Aldrich | Fijación Celular | |
| SLBR6504V SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA u otras alternativas de solución de bloqueo |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergente para permeabilizar células |
| Conejo anti-CaV1.2 (FP1) | Regalo | N/A | Existen anticuerpos comerciales anti-CaV1.2 como Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Monoclonal de ratón anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Anticuerpo primario |
| Alexa Fluor 647 donket anti-conejo IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Anticuerpo secundario |
| Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Anticuerpo secundario |
| Azida sódica | Sigma | S2002 | Previene el crecimiento microbiano para el almacenamiento a largo plazo de muestras |
| Catalasa | Sigma | C40 | Ingrediente del tampón de fotoconmutación |
| Glucosa oxidasa | Sigma | G2133 | Ingrediente del tampón de fotoconmutación |
| Tris | Sigma | T6066 | Ingrediente del tampón de fotoconmutación |
| beta-Mercaptoetilamina Clorhidrato de | Fisher BP2664100 | Fisher | |
| beta;-mercaptoetanol | Sigma | 63689 | Ingrediente tampón de fotoconmutación |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Ingrediente tampón de fotoconmutación |
| Dextrosa | Fisher | D14-212 | Ingrediente tampón de fotoconmutación |
| Portaobjetos de depresión de vidrio | Neolab | 1 – 6293 | Para montar muestras |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | Para sellar cubreobjetos |
| sec61β- Plásmido mCherry | Addgene | 49155 | |
| Microscopio 3D Leica SR GSD | Leica | ||
| ImageJ | |||
| bloques de lavado | 20 % SEAblock en PBS | ||
| Solución | 0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, en PBS | ||
| Solución | de incubación de anticuerpos secundarios1:1000 en PBS |
Referencias
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
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Reimpresiones y permisos
