إطلاق مولر خلية التنشيط في تنكس الشبكية المستحثة بالليزر ونموذج التجديد في الزرد
Summary
الزرد نموذج حيوان شعبية لدراسة آليات تنكس الشبكية/التجدد في الفقاريات. ويصف هذا البروتوكول وسيلة للحث على إصابة مترجمة تعطيل الشبكية الخارجي مع الحد الأدنى من الضرر للشبكية الداخلية. وفي وقت لاحق، نقوم بمراقبة في فيفو مورفولوجية الشبكية ورد إطلاق مولر في جميع أنحاء التجدد الشبكية.
Abstract
فرق رائعة بين تيليوست والثدييات هي إمكانية مدى الحياة الشبكية تيليوست للخلايا الشبكية وتجديدها بعد أضرارا جسيمة. التحقيق في سبل التجدد في الزرد قد تجلب أفكاراً جديدة لتطوير استراتيجيات مبتكرة لعلاج الأمراض التنكسية الشبكية في الثدييات. هذه الوثيقة، ركزنا على تقلد الآفة تركيزه على شبكية العين الخارجي في الزرد الكبار عن طريق ليزر صمام ثنائي 532 نانومتر. ويسمح بإصابة مترجمة التحقيق في العمليات البيولوجية التي تحدث أثناء تنكس الشبكية وتجديدها مباشرة في المجال الأضرار. باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية غير الغازية (OCT)، كنا قادرين على تحديد موقع تلف المنطقة ورصد التجديد اللاحقة المجراة في. في الواقع، تنتج أكتوبر تصوير الصور ذات الدقة العالية، مستعرضة الشبكية الزرد، تقديم المعلومات التي كانت متاحة في السابق إلا بالتحليل النسيجي. من أجل تأكيد البيانات من أكتوبر في الوقت الحقيقي، أجريت مقاطع نسيجية وحققت استجابة التجدد بعد تنصيب إصابة الشبكية إيمونوهيستوتشيميستري.
Introduction
الرؤية هو على الأرجح بمعنى الأكثر أساسية للإنسان وبه ضعف أثر اقتصادية عالية. في العالم الصناعي، والأمراض التنكسية الشبكية تمثل الأغلبية من فقدان البصر والعمى بين السكان البالغين1. التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو السبب الأكثر شيوعاً للعمى في الأشخاص بين سن 20 و 60، التي تؤثر على حوالي 1.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم2،3الموروثة. أنها عائلة غير متجانسة من اضطرابات الشبكية الموروثة التي تتميز بالفقدان التدريجي ل photoreceptors (الحد من الفقر) متبوعاً بانحطاط ظهارة صباغ الشبكية، وفي وقت لاحق، الدباق ويعيد البناء من الخلايا العصبية الداخلية4. ويمكن تفسير مسار المرض عن فقدان تزايدي لهذين النوعين خلية العلاقات العامة، عادة بدءاً من قضبان، التي تعتبر مسؤولة عن الرؤية متعامي في ضوء خافت، والأقماع، التي تعتبر أساسية ل الرؤية والبصر لون5. عيب واحد من جينات كافية لتتسبب في البرنامج العادي. حتى الآن أكثر من 130 من الطفرات في الجينات ما يزيد على 45 كانت مرتبطة ب المرض6. وهذا يؤدي إلى اختلاف المرض تعمل وهو أحد الأسباب أن العلاج الجيني عدم التعميم ونهج علاجية معقدة وبالتالي. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير النهج العلاجية العامة الجديدة لعلاج تنكسات الشبكية في الأمراض المسببة للعمى.
ضمور الشبكية وكثيراً ما ينطوي على خسارة العلاقات العامة؛ ولذلك، موت الخلية العلاقات العامة السمة مميزة للعمليات التنكسية في الشبكية7. وقد ثبت فعلا أن موت الخلية PR يحفز مولر إطلاق الخلية (MC) تنشيط وانتشار8. الرصد والمراقبة، واعتبرت نوع الخلية الدبقية الرئيسية في الشبكية الفقارية، مرة واحدة إلى شيء أكثر من “غراء” بين الخلايا العصبية الشبكية. في السنوات الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات أن الإشراف تعمل أكثر من مجرد الهيكلية ودعم9. من بين وظائف مختلفة، المشاركة أيضا في الخلايا MCs وإصلاح10. في الواقع، استجابة لعوامل ديفوسيبلي من تردي الشبكية، زيادة MCs كبيرة التعبير الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني). ولذلك، يمكن استخدام توصيني وسمها كعلامة للتنشيط MC كاستجابة ثانوية لإصابة الشبكية وضمور11.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير رواية تكيف لإصابة التنسيق باستخدام ليزر لحمل تنكس الشبكية في الزرد (دانيو rerio). إصابة التنسيق مفيد لدراسة بعض العمليات البيولوجية مثل هجرة الخلايا في الموقع المتضرر والتوقيت الدقيق للأحداث التي تجري أثناء التجديد الشبكية12. وعلاوة على ذلك، أصبحت الزرد هامة في الأبحاث البصرية بسبب أوجه التشابه بين نظامها البصرية وغيرها من الفقاريات. السمات المورفولوجية وغذائها الإجمالي من ريتيناي البشرية وتيليوست عرض الاختلافات القليلة. وبناء على ذلك، ريتيناي الإنسان والزرد تحتوي على نفس الفئات الرئيسية الخلية نظمت في نفس النمط الطبقات، حيث تحتل استشعار الضوء photoreceptors الطبقة الأبعد، بينما الإسقاط الشبكية الخلايا العصبية، خلايا العقدة، يقيم في الأعمق طبقة الخلايا العصبية والدانية للعدسة. إينتيرنيورونس الشبكية، أماكريني، بين القطبين، والخلايا الأفقية، ترجمة ما بين مستقبله والعقدة طبقات الخلية13. وعلاوة على ذلك، الشبكية الزرد يهيمن عليها مخروط وذلك أقرب إلى شبكية العين البشرية من، على سبيل المثال، في دراسة مكثفة الشبكية القوارض. فرق رائعة بين تيليوست والثدييات هي الخلايا الثابتة في الشبكية الأسماك والتجدد الشبكية بعد الضرر. في الزرد، يمكن الإشراف ديديفيرينتياتي والتوسط من أجل التجديد في الشبكية الجرحى14،15. وقد الإشراف في الدجاج، بعض القدرة أيضا على إعادة إدخال دورة الخلية وديديفيرينتياتي. عقب إصابة الشبكية في الأسماك الكبار، تعتمد بعض الخصائص للسلف والخلايا الجذعية MCs وتهاجر إلى نسيج الشبكية التالفة وإنتاج الخلايا العصبية الجديدة16. التنميط التعبير الجيني من الثدييات MCs كشفت عن أوجه التشابه غير متوقع إلى فروعه الشبكية، وتزايد الأدلة على إمكانات العصبية الذاتية للرصد والمراقبة في الدجاج، والقوارض، وشبكية العين البشرية حتى17. ومع ذلك، لماذا رد التجدد في الطيور والثدييات هي أقل مقارنة مع استجابة قوية في الأسماك هو لم تفهم بعد. ولذلك، فهم آليات الإصلاح الذاتية في الزرد قد اقترح استراتيجيات لحفز التجدد الشبكية في الثدييات والبشر. تستخدم إليه إصلاح الذاتية للإشراف كأداة علاجية لعلاج المرضى الذين يعانون من تنكس الشبكية سيكون له أثر غير المسددة لمجتمعنا.
هنا، نحن نقدم الخطوات اللازمة لتوظيف نموذج الانحطاط/التجديد في أبحاث العيون. نحن ركز أولاً على أحداث الضرر المحورية في الشبكية الحسية، ثم على تصوير الأحداث النامية في موقع الإصابة، وأخيراً نحققها مشاركة MCs المتاخمة. من السهل نسبيا لتنفيذ البروتوكول العام ويفتح مجموعة متنوعة واسعة من الإمكانيات لتقييم الشبكية بعد ذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
تجديد/تنكس الشبكية في الزرد كانت قد أجرت التحقيق نهج مختلفة مثل موت الخلية بوساطة سيتوتوكسين22والإصابة الميكانيكية23إصابة الحرارية24. استخدمنا 532 نانومتر ليزر صمام ثنائي تلف الشبكية الزرد. وبالتالي، لدينا نموذج يوفر العديد من المزايا. على سبيل المثال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر مارتن زنكيرناغل، دكتوراه في الطب ودكتوراه وميريام ريسينهوفير، دكتوراه لبلدها المدخل العلمي في وضع النموذج ونشهده فريدريكا لها المساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
