Активации клеток глии Мюллер в лазерно индуцированным дегенерации сетчатки и регенерации модель в данио рерио
Summary
Данио рерио является популярной модели животных для изучения механизмов сетчатки дегенерации/регенерации в позвоночных. Этот протокол описывает метод побудить локализованных травмы, нарушая наружной сетчатки с минимальным ущербом для внутренней сетчатки. Впоследствии мы осуществляем мониторинг в vivo сетчатки морфология и Мюллер глии ответ всей регенерации сетчатки.
Abstract
Увлекательный костистых млекопитающих отличается от непрерывного потенциал костистых сетчатки для сетчатки Нейрогенез и восстановление после серьезного ущерба. Исследование путей регенерации в zebrafish может принести новые идеи для разработки новаторских стратегий для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки в млекопитающих. Здесь мы сосредоточились на индукции фокуса поражения внешних сетчатки в взрослых рыбок данио посредством 532 нм Лазер диода. Локализованные травмы позволяет исследовать биологические процессы, которые происходят во время дегенерации сетчатки и регенерации непосредственно в зоне повреждения. С помощью неинвазивных оптическая когерентная томография (Окт), мы были в состоянии определить местоположение поврежденного монитора и области последующей регенерации в vivo. Действительно OCT изображений производит изображения с высоким разрешением, поперечного сечения данио рерио сетчатки, предоставляя информацию, которая была ранее доступна только с гистологическим анализом. Для подтверждения данных от реального времени октября, были исполнены Гистологические срезы и регенеративной ответ после индукции сетчатки травмы были исследованы иммуногистохимия.
Introduction
Видение, вероятно, наиболее важным чувство человека и его обесценения имеет высокие социально экономические последствия. В промышленно развитых странах дегенеративных заболеваний сетчатки составляют большинство потери зрения и слепоты среди взрослого населения1. Пигментный ретинит (RP) является наиболее распространенной причиной унаследованные слепоты у людей в возрасте от 20 до 60, затрагивающих примерно 1,5 миллиона человек во всем мире2,3. Это семейство разнородных наследственных заболеваний сетчатки, характеризуются постепенной утратой фоторецепторов (PRs) следуют дегенерация сетчатки пигментного эпителия и, впоследствии, глиоза и реконструкция внутренних нейронов4. Течение заболевания можно объяснить добавочные потери двух типов клеток PR, обычно начиная с стержней, которые отвечают за ахроматические видение в тусклом свете и конусов, которые необходимы для цвет видение и острота5. Дефект одного гена достаточно, чтобы вызвать RP. Пока более чем 130 мутаций в генах, более 45 были связаны с болезнью6. Это приводит к той или иной болезни фенотипы и является одной из причин, что генная терапия не обобщаемым и таким образом замысловатые терапевтический подход. Таким образом существует настоятельная необходимость разработать новые общие терапевтические подходы для лечения дегенерации сетчатки в ослепительно заболеваний.
Дегенерация сетчатки часто включает в себя потери PR; Таким образом смерть клетки PR является отличительной чертой дегенеративных процессов в сетчатке7. Уже было продемонстрировано, что смерть клетки PR стимулирует Мюллер глии клеток (MC) активации и распространения8. МКН, тип основных глиальных клеток сетчатки позвоночных, когда-то считались не более чем «клей» между сетчатки нейронов. В последние годы многие исследования показали, что MCs действовать как больше, чем просто структурной поддержки9. Среди различных функций MCs также участвуют в Нейрогенез и ремонт10. Действительно в ответ на diffusible факторов от вырождающихся сетчатки, MCs значительно увеличить глиальных фибриллово кислой (СВМС) белков. Таким образом СВМС маркировки может использоваться в качестве маркера для активации MC в средней ответ сетчатки травмы и дегенерации11.
Недавно мы разработали Роман адаптации фокуса травмы с помощью лазера, чтобы побудить дегенерации сетчатки в данио рерио (Danio рерио). Для изучения некоторых биологических процессов, таких как миграция клеток на потерпевшего сайт и точное время событий, которые происходят во время регенерации сетчатки12выгодно фокуса травмы. Кроме того данио рерио стало важным в визуальные исследования из-за сходства между своей зрительной системы и других позвоночных. Грубые гистологических особенностей человека и костистых retinae отображать несколько различий. Соответственно человека и данио рерио retinae содержат те же классы основных клеток, организованной в той же многоуровневой схеме, где светочувствительных фоторецепторов занимают внешний слой, в то время как сетчатки проекции нейронов, клетках ганглия, проживают в сокровенное нейронов слоя, проксимальнее объектива. Сетчатки интернейронов, Амакриновые, биполярный и горизонтальные клетки, локализовать между фоторецептор и ганглий клеток слои13. Кроме того данио рерио сетчатки, доминировали в конус и поэтому ближе к человека сетчатки, чем, например, интенсивно изучали грызунов сетчатки. Увлекательный костистых млекопитающих отличается от стойких нейрогенез рыбы сетчатки глаза и сетчатки восстановление после повреждения. В данио рерио MCs можно дедифференцироваться и посредником регенерации в раненых сетчатки14,15. В курицу MCs имеют некоторые способности также повторно ввести клеточного цикла и дедифференцироваться. После сетчатки травмы в взрослых рыб MCs принять определенные характеристики прародителем и стволовых клеток, перенести поврежденных тканей сетчатки и производить новые нейроны16. Ген выражение профилирование млекопитающих МКН показал неожиданные сходство сетчатки прародителями, и доказательств для встроенных нейрогенный потенциал МКН в курицу, грызунов и даже человека сетчатки растет17. Тем не менее, почему восстановительной реакции у птиц и млекопитающих ниже по сравнению с надежным ответом в рыбе не еще не понимается. Таким образом понимание механизмов внутреннего ремонта в zebrafish может предложить стратегии стимулирования регенерации сетчатки в млекопитающих и человека. Используя механизм эндогенного ремонт МКН как лечебное средство для лечения больных с дегенерация сетчатки скажется выдающийся для нашего общества.
Здесь мы предоставляем шаги необходимо использовать модель дегенерации/регенерации в офтальмологических исследований. Мы в первую очередь на вызывающие фокуса повреждения в нейросенсорной сетчатки, затем по визуализации событий, развивающихся на сайт травмы и наконец визуализации участие соседних MCs. Общий протокол относительно легко выполнить и открывает широкий спектр возможностей для оценки сетчатки потом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Регенерации/дегенерация сетчатки в zebrafish были расследованы различных подходов, таких как cytotoxin опосредованной клеток смерти22, механическая травма23и термической травмы24. Мы использовали 532 нм Лазер диода повреждения сетчатки у рыбок данио. Таким о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Martin Zinkernagel, MD, PhD и Мириам Reisenhofer, PhD за ее научного вклада в создание модели и Федерика Bisignani за ее превосходную техническую помощь.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
