ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化
Summary
ゼブラフィッシュは、脊椎動物の網膜変性・再生のメカニズムを勉強する人気動物モデルです。このプロトコルでは、ローカライズされた外傷の内側の網膜に最小の被害で網膜の外側を中断することを誘導する方法について説明します。その後、我々 は生体内で網膜の形態と網膜再生を通してミュラー グリア細胞応答監視します。
Abstract
硬骨魚と哺乳類の魅惑的な違いは、魚類の網膜網膜神経新生と重度の損傷後の再生のための生涯の可能性です。ゼブラフィッシュにおける再生経路の調査は哺乳類の網膜変性疾患の治療のための革新的な戦略を開発する新しい洞察力をもたらす可能性があります。ここで、532 nm ダイオード レーザーによる大人のゼブラフィッシュの網膜の外側に病巣の誘導に注力しました。ローカライズされた損傷は、網膜変性・損傷の領域で直接再生時起こる生物学的プロセスを調査できます。我々 は、破損した領域とモニター以降再生の場所を定義するができた非侵襲的光コヒーレンストモグラフィ (OCT) を使用して、体内。確かに、OCT イメージングは、組織学的分析でだけ以前利用可能だった情報を提供するゼブラフィッシュ網膜の断面、高解像度の画像を生成します。組織切片を行ったリアルタイム 10 月からデータを確認するために、免疫組織化学による網膜損傷の誘導後の再生の応答を調べた。
Introduction
ビジョンは、おそらく人間の最も本質的な意味とその損傷が高い社会経済的影響。工業化された世界で網膜変性疾患は視力低下や失明成人人口の1間の大半を占めています。網膜色素変性症 (RP) は、約 150 万人世界2,3に影響を与える 60、および 20 の年齢間の人々 の失明の最も一般的な継承された原因です。遺伝性網膜疾患網膜色素上皮細胞と、その後神経膠症の変性が続くし、内部のニューロン4の改造 (PRs) 光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられる異種族です。病気のコースは、通常、薄暗い光と色検査および視力5に欠かせないコーンで明暗視に責任がある棒で開始 2 つの PR セル型の増分の損失によって説明できます。単一の遺伝子異常は、RP を引き起こすのに十分です。これまでのところ以上 130 以上 45 遺伝子変異は6疾患に関連付けられています。これは、さまざまな疾患の表現型につながる、遺伝子療法は非汎化可能な理由の 1 つ、従って複雑な治療アプローチ。したがって、まばゆいばかりの疾患で網膜変性を治療する新しい一般的な治療方法を開発する急務があります。
しばしば網膜変性を含む PR 損失;そのため、PR 細胞死、7網膜の変性プロセスの特徴です。すでに、広報細胞死がミュラー グリア細胞 (MC) 活性化と増殖8を刺激することが実証されています。MCs、脊椎動物の網膜では、主要なグリア細胞型が網膜ニューロン間「接着剤」以外の何物であると考えた。近年、多くの研究は、MCs 行動以上の単なる構造は9をサポートすることを示しています。別の関数に MCs は神経新生にも関与し、10を修復します。確かに、変性網膜から拡散性因子に応答して、MCs は大幅、グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) 表現を高めます。したがって、GFAP のラベリングは、網膜損傷し変性11二次応答として MC 活性化のマーカーとして使用できます。
最近では、(動脈分布) ゼブラフィッシュの網膜変性を誘発するレーザーを用いた焦点損傷のグラフィックノベルの適応を開発しました。焦点の損傷は、損傷部位に細胞の移動と網膜再生12中に行われるイベントの正確なタイミングなど特定の生物学的過程を研究するため有利です。さらに、ゼブラフィッシュは、その視覚システムと他の脊椎動物との間の類似性のため視覚研究で重要になりました。人間と魚類の網膜の総の形態学的および組織学的特徴は、いくつかの違いを表示します。人間とゼブラフィッシュの網膜が網膜投射神経細胞、神経節細胞は内側に存在しながら、光を感じる視細胞が最も外側の層を占める同じ層状パターンで構成されて同じの主要な細胞クラスを含むしたがって、レンズに近位の神経層。網膜の介在神経細胞、アマクリン細胞、バイポーラ、水平細胞の光受容細胞と神経節細胞層13の間にローカライズします。さらに、ゼブラフィッシュの網膜はコーンを支配し、したがってより、集中的に調査の齧歯動物の網膜など、人間の網膜に近い。硬骨魚と哺乳類の魅惑的な違いは、魚網膜と損傷後の網膜の再生に永続的な神経です。ゼブラフィッシュ、MCs が脱分化し、負傷した網膜14,15再生を仲介できます。鶏肉, MCs 脱分化して細胞周期を再入力にもいくつかの容量があります。成魚で網膜外傷後に MCs は前駆細胞および幹細胞の特定の特性を採用する、損傷した網膜組織に移行し、新しいニューロン16を生成します。網膜前駆細胞に予期しない類似点を明らかに哺乳類の MCs の遺伝子発現プロファイリングとチキン、齧歯動物、人間の網膜で MCs の組み込み神経因性潜在性のための証拠は17に成長しています。それにもかかわらず、鳥類や哺乳類の再生応答は魚で頑健な応答とに比べて低い理由はまだ分かっていません。したがって、ゼブラフィッシュの内因性の修復メカニズムを理解することは、哺乳類と人間の刺激的な網膜再生のための戦略を提案するかもしれない。網膜変性症患者の治療のため治療のツールとしては、MCs の内因性修復機構を採用私たちの社会の顕著な影響を与えるでしょう。
本明細書では、眼科研究の変性・再生モデルを採用するための手順を提供します。我々 はまず損傷部位と隣接する MCs の最後に可視化の関与を開発イベントのイメージングで、麻痺の網膜で焦点の損傷を誘発するのに焦点を当てた。一般的なプロトコルは、比較的簡単に行うさまざまな網膜をその後評価のための可能性を開きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュの網膜再生/変性は、毒素による細胞死22、機械的損傷23、熱傷24などさまざまなアプローチが検討されています。ゼブラフィッシュの網膜を損傷する 532 nm ダイオード レーザーを採用しました。これにより、我々 のモデルは、いくつかの利点を提供しています。例えば、我々 は急速に PRs 層の具体的には、網膜の外側に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼女の優秀な技術的な支援のモデルとデリカ Bisignani の確立で彼女の科学的な入力をマーティン ツィンカーナーゲル、MD、PhD、ミリアム Reisenhofer、PhD を感謝いたします。
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
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