Forberedelse af Keratin hydrolysat fra kylling fjer og dens anvendelse i kosmetik

Summary

Målet med protokollen er at forberede keratin hydrolysat fra kylling fjer ved alkaline-enzymatisk hydrolyse og teste, om tilføjelse af keratin hydrolysat i en kosmetik salve base forbedrer hudens barriere funktion (hvilket øger hydrering og faldende transepidermal vandtab). Tests er udført på mænd og kvinde frivillige.

Abstract

Keratin hydrolysater (KHs) er etableret standardkomponenter i hår kosmetik. Forstå de fugtgivende effekt på KH er fordelagtige for hudpleje kosmetik. Målene for protokollen er: (1) at behandle kylling fjer i KH ved alkaline-enzymatisk hydrolyse og rense det ved dialyse, og (2) hen til overhøre selv tilføje KH i en salve base (OB) øger hydrering af huden og forbedrer hudens barriere funktion ved faldende transepidermal vandtab (TEWL). Under alkaline-enzymatisk hydrolyse inkuberes fjer først ved en højere temperatur i et alkalisk miljø og derefter under milde betingelser, hydrolyseres med proteolytiske enzym. Løsning af KH er dialysebehandling, vakuum tørres og formales til et fint pulver. Kosmetiske formuleringer bestående af olie i vand emulsion (O/W) der indeholder 2, er 4 og 6 vægtprocent af KH (baseret på vægten af OB) forberedt. Test de fugtgivende egenskaber for KH er udført på 10 mænd og 10 kvinder med gang intervaller af 1, 2, 3, 4, 24 og 48 h. testet formuleringer er spredt på affedtede volar underarmen websteder. Huden hydrering af stratum corneum (SC) vurderes ved at måle kapacitans af huden, som er en af de mest verdensomspændende anvendte og enkle metoder. TEWL er baseret på at måle mængden af vandet transporteres pr. et afgrænset område og periode fra huden. Begge metoder er fuldstændig ikke-invasiv. KH gør for en fremragende okklusiv; afhængigt af tilsætning af KH i OB bringer det en 30% reduktion i TEWL efter ansøgning. KH også fungerer som en fugtighedsbevarende middel, da det binder vand fra de lavere lag af epidermis til SC; ved optimal KH tilføjelsen i OB opstår op til 19% stigning i hydrering i mænd og 22% stigning i kvinder.

Introduction

Slagterier, fødevareindustrien og garvning industri producere årligt enorme mængder af solid keratin biprodukter-uld, fjer, børster, klove, kløer, horn og lignende. Ifølge seneste statistiske data er den samlede levende vægt af høns, kalkuner, ænder og andre slagtede fjerkræ i USA 62,5 milliarder pund pr. år¹; i EU er det ca. 28,7 milliarder pund om året. I betragtning af at fjer gøre op til 8,5% af den samlede fjerkræ vægt, producerer USA alene årligt ca. 5,3 milliarder pounds af affald fjer².

Keratin er et protein, udstiller høj kemisk resistens, fordi det er stærkt krydsbundet med disulfidbroer, at gengive dens forarbejdning vanskeligt. At opnå opløselige produkter kræver holde cross-links og eventuelt gennemføre hydrolyse af peptidbindinger³. Spaltning af disulfidbroer kan fortsætte gennem en reaktion af thiol anion efter følgende mønster^4,5:

S_et^– + – S_bS_c-↔ – S_b^– + – S_enS_c^–

Med en meget høj pH-niveau vises hydrolyse af disulfidbroer også, efter mønster⁶

-SS^– + OH^– → – S^– + – SOH

Under milde forhold (pH ca. 8) sted selv sulfitolysis finder efter følgende mønster:

-SS – + HSO₃^– → – SH + -SSO₃^–

Den mest økonomiske måde nedværdigende keratin er mikrobiel nedbrydning, som er karakteriseret ved mild reaktionsbetingelser under forarbejdning og høj opdeling effektivitet (ca. 90%)^7,8. Keratinases er produceret af visse bakterier isoleret fra jord og keratin affald⁹. Mikrobielle keratinases hydrolyserer stive og stærkt krydsbundet keratin strukturer¹⁰ og den resulterende KH forberedt er rig på opløselige proteiner, uden tab i essentielle aminosyrer opdaget i det¹¹.

For at indarbejde en protein i kosmetiske præparater (f.eks., emulsioner, cremer og geler), sikre kravet om at at sådanne proteiner er opløseligt i vand, de givne systemer er gennemsigtige, og at re sammenlægning af peptider er undgået grund hydrofobe interaktioner. En fælles praksis er derfor at anvende hydrolysater af proteiner, som hydrolyseret kollagen, elastin og keratin. Når du tilføjer hydrolysater i kosmetiske emulsioner, taget skridt til at sikre, at hydrolysat først opløses i vand. I nogle tilfælde er det ønskeligt, at protein (eller hydrolysat) er opløseligt i alkohol eller andre organiske opløsningsmidler¹².

KH er normalt kendetegnet i shampoo, balsam, cremer og nærende serum for hår, samt mascaras, neglelak og eye make-up agenter. KH effekter erklæret normalt omfatter danner en beskyttende film, udglatning hår eller negle struktur, øget plasticitet og udseende af de behandlede formation, regulering af sammenhængen i produkter, og at fremme dannelsen af skum^{13 , 14}. det fremgår også, at KH nedsætter overfladespænding, dermed tilskud i kosmetik kan lette reduktion i mængden af emulgator tilføjet for at stabilisere cremer. KH begrænse virkningerne af irritation udløst af rengøringsmidler (overfladeaktive stoffer) til hud, øjne og hår, hvorved nogen potentielle bivirkninger af rengøringsmidler på væv (f.eks, dehydrering af huden, hårdhed og nedsat barriere funktion af hud). Den høje buffer kapacitet af hydrolysater også udnyttes til at stabilisere pH af kosmetik; peptider af kortere længde har en større Bufferkapacitet virkning^15,16. Selvom KHs har blive etableret som standard komponenter i hår og negle kosmetik samt ved at blive udnyttet i produkter til hudpleje, undersøgelser af fugtgivende virkningerne af KH ikke vises i moderne litteratur.

Alkaline-enzymatisk teknologi er blevet udviklet til forarbejdning keratin biprodukter til KH og aktive test er i processen om virkningerne af en række kosmetiske additiver^{17,18,19,20 , 21 , 22}. fordelen, at to-trins alkaline-enzymatisk hydrolyse ved hjælp af mikrobielle proteaser for kylling fjer opnår høj effektivitet mild reaktion betingelser og kvaliteten af KH er meget høj i modsætning til hydrolyse ansat i stærke syrer eller baser. I den første fase inkuberes fjer ved en højere temperatur i et alkalisk miljø, som delvist forstyrrer keratin struktur og svulmer fjer; efter justering af pH, er fjer hydrolyseret med et proteolytisk enzym milde betingelser i anden fase. Den dialyzed KH besidder et højt indhold af proteiner.

Anvendelsen af metoden beskrevet her forarbejdning fjerkræfjer til en KH gennem alkaline-enzymatisk hydrolyse og teste effekten af fugtgivende egenskaber af KH anvendes til O/W kosmetiske emulsion. De fugtgivende egenskaber er undersøgt af medvirkende ikke-invasive metoder i vivo. De hyppigste metoder til måling hud hydrering og barriere funktion af SC omfatter måling af elektriske egenskaber af huden (konduktans eller kapacitans). Forskellige metoder for at undersøge SC hydrering omfatter nær infrarød multispektrale at forestille sig metode (NIM), Kernemagnetisk resonans-spektroskopi, optisk kohærens tomografi eller forbigående termotransfer²³. Barriere funktion af SC korrelerer til TEWL SC og det er målt ved ventileret kammer metode, unventilated kammer metode og åben kammer metode²⁴.

Egenskaber af model formuleringer bestemmes ved hjælp af Multi sonde adapter MPA 5 med tre typer af sonder. Den først én, corneometer CM 825 foranstaltninger hud hydrering ved at vurdere ændringerne i den elektriske kapacitet på hudens overflade; den måling kondensator viser ændringer i kapacitans af hudens overflade i corneometric enheder. Corneometer giver kun en relativ vurdering af huden hydrering²⁵. For TEWL, der den anden sonde, tewameter TM 300, bruges til måling tæthed farveforløb af vand fordampning (i en åben kammer instrument baseret på Fick’s diffusion lov) fra huden indirekte af de to par af følere (temperatur og relativ fugtighed) angiver mængden vand der transporteres pr. et afgrænset område og periode (g/m²h). Denne metode kan registrere selv de mindste forstyrrelser af hud barriere funktion²⁶. Hud pH-værdien er en indikator for barriere og anti-mikrobielle funktion af SC²⁷. Surhedsgraden i huden kappen blev målt af en (tredje) hud PH 905 probe tilsluttet MPA 5 station. Denne specialdesignet sonden består af en flad top glas elektrode til fuld hudkontakt, tilsluttet et voltmeter. Systemet måler potentielle ændringer som følge af aktiviteten af hydrogen kationer omkring den meget tynde lag af halvfaste former målt på toppen af sonden. Ændringer i spænding vises som pH²⁸.

Vi præsenterer forsøg opdelt i tre dele: (1) forberedelse af KH fra kylling fjer af to-trins alkaline-enzymatisk hydrolyse og dets rensning af dialyse (at fjerne salte og lav-Molekylær fraktioner), (2) udarbejdelse af kosmetiske formuleringer, der indeholder 2, 4 og 6% KH, og (3) test egenskaberne for KH ved at måle hud hydrering, TEWL, og hud pH. Test blev udført på 10 kvinder med en gennemsnitlig alder af 27,2 år og 10 mænd med en gennemsnitlig alder af 26,2 år. Metoden til udvælgelse af frivillige og selve testen blev gennemført i overensstemmelse med internationale etiske principper for bio-medicinske forskning udnytte forsøgspersoner²⁹; alle personer, der gav deres informeret samtykke forud for optagelse i undersøgelsen. Før testning påbegyndt, frivillige blev bedt om at udfylde et spørgeskema om deres sundhedsstatus. De frivillige er forpligtet til at undgå at anvende et kosmetisk produkt til forsøgssteder og omkringliggende områder i løbet af 24 timer forud for og under testperioden; Derudover var de kun tilladt korte aften vasker med rindende vand.

Protocol

Volontører rekrutteret blandt ansatte og studerende på vores Universitet. Metoden til udvælgelse blev gennemført i henhold til “International etiske retningslinjer for biomedicinsk forskning af forsøgspersoner. Rådet for internationale organisationer af Medical Sciences, Geneve (2002).” KH er en fælles kosmetisk ingrediens bruges i hårpleje produkter (shampoo, Crimper, etc.) og dermed der ikke kræves godkendelse fra de institutionelle review board. 1. proces kylling fjer i KH<…

Representative Results

KH tilberedt efter procedure præsenteres her (Se figur 2) er gul i farven, let opløseligt i vand med højt proteinindhold (uorganiske legemer repræsenterer < 2,0%); pH-værdien på 1,0% opløsning af KH er 5.3, og opfylder kravene til kosmetik-grade hydrolysater. KH udbytte fra råvarer til 50 g er ca. 30%. Molekylvægt distribution af KH var bestemt af SDS-PAGE og er vist i figur 3. <p class="jove_content" fo:keep-togethe…

Discussion

Fordelen ved alkaline-enzymatisk hydrolyse er, at det kan blive ændret efter fremtidige anvendelser af KH. For eksempel, i hårpleje kosmetik applikationer, hvor en let brunlig farve af et produkt ikke er en hindring, kan en højere temperatur i hydrolyse anvendes fører til et højere udbytte af KH. Derudover den længere behandlingstid i begge faser af proceduren for teknologiske væsentligt påvirker den overordnede proces effektivitet – udbytte af KH stiger til 85%.

Resultater for hydre…

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH		MPA 5 station operating software