Ein Protokoll zur Untersuchung der Desensibilisierung und Empfindlichkeit sebung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit wird vorgestellt.
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Methodenartikel
Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Methode zur Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung von Krebsphotorezeptoren wird vorgestellt. Wir führten intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenstielen mit der diskontinuierlichen Konfiguration der Einzelelektroden-Geschalteten Spannungsklemme durch. Zuerst haben wir mit einer Rasierklinge eine Öffnung in der dorsalen Hornhaut gemacht, um Zugang zur Netzhaut zu erhalten. Danach setzten wir eine Glaselektrode durch die Öffnung ein und drangen in eine Zelle ein, wie durch die Aufzeichnung eines negativen Potentials berichtet. Das Membranpotential wurde auf das Ruhepotential des Photorezeptors eingeklemmt und ein Lichtimpuls angewendet, um Ströme zu aktivieren. Schließlich wurde das zwei Lichtblitzprotokoll verwendet, um die aktuelle Desensibilisierung und Wiederherstellung zu messen. Der erste Lichtblitz löst nach einer Verzögerungsperiode den transduktionsionischen Strom aus, der nach Erreichen einer Spitzenamplitude in einen desensithissiierten Zustand abfällt; der zweite Blitz, der in unterschiedlichen Zeitintervallen angewendet wird, bewertet den Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit. Um den lichtentwirrten Strom zu charakterisieren, wurden drei Parameter gemessen: 1) Latenz (die Zeit, die zwischen der Lichtblitzabgabe verstrichen ist, und dem Moment, in dem der Strom 10% seines Maximalwerts erreicht); 2) Spitzenstrom; und 3) Desensibilisierungszeitkonstante (exponentielle Zeitkonstante der aktuellen Zerfallsphase). Alle Parameter werden vom ersten Impuls beeinflusst.
Um die Erholung von der Desensibilisierung zu quantifizieren, wurde das Verhältnis p2/p1 im Vergleich zur Zeit zwischen den Impulsen verwendet. p1 ist der Spitzenstrom, der durch den ersten Lichtimpuls evoziert wird, und p2 ist der Spitzenstrom, der vom zweiten Impuls evoziert wird. Diese Daten wurden an eine Summe exponentiver Funktionen angepasst. Schließlich wurden diese Messungen in Abhängigkeit von der zirkadianen Zeit durchgeführt.
Einleitung
Um als visueller Reiz wahrgenommen zu werden, muss Licht, das die Augen erreicht, in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Somit löst Licht in allen visuellen Organismen einen Transduktionsionenstrom aus, der wiederum eine Veränderung des Membranpotenzials von Photorezeptorzellen, dem sogenannten Rezeptorpotential, bewirkt. Aus diesem Grund hängt die Lichtempfindlichkeit des Auges in erster Linie vom Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit ab, die entweder aktiviert oder desensizipiert werden kann.
Bei Krebsphotorezeptoren löst Licht einen langsamen, transienten, ionischen Stromaus 1. Bei der Beleuchtung ent....
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Protokoll
HINWEIS: Die Experimente entsprechen den Tierschutzgesetzen Mexikos.
1. Versuchsaufbau
- Allgemeine Verbindungen
- Schließen Sie den Verstärker über einen Analog-Digital-Wandler an einen geeigneten Computer an und verwenden Sie ein Oszilloskop, um das Experiment zu überwachen (Abbildung 1).
- Verbinden Sie den Photostimulator mit dem konvertierten A/D.
- Aufnahmekammer
- Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf einen Anti-Vibrations-Tisch und lokalisieren Sie sie in einem Faraday-Käfig.
HINWEIS: Dies verhindert mechanische Vibrationen und elektrische Geräusche, ....
- Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf einen Anti-Vibrations-Tisch und lokalisieren Sie sie in einem Faraday-Käfig.
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Ergebnisse
Zunächst wird ein repräsentatives Rezeptorpotential von Krebsphotorezeptorzellen erhalten (Abbildung 4). Anschließend wurde ein Testlichtblitz angewendet, um den Lichttransduktionsstrom auszulösen (Abbildung 5). Der kationische Transduktionsstrom1 aktiviert sich nach einer Verzögerung, erreicht ein Maximum und fällt danach langsam in einen absorbierenden desensinationen Zustand, aus dem er sich langsam erh.......
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Diskussion
Die Krebse haben sich als ausgezeichnetes Modell erwiesen, da sie unter nicht-natürlichen Bedingungen überleben können. Es gibt einen einfachen Zugang zu elektrophysiologischen In-vivo- und In-vitro-Analysen. Darüber hinaus sind Krebstiere eine günstige Gruppe für neurobiologische Forschung auf dem Gebiet der vergleichenden Chronobiologie21.
In diesem Beitrag wird die Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten Transd.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch dGAPA-UNAM IN224616-RN224616-Zuschuss unterstützt. Die Autoren danken Frau Josefina Bolado, Leiterin der Abteilung für wissenschaftliche Übersetzung von Papieren, aus divisién de Investigacion in facultad de Medicina, UNAM, für die Bearbeitung der englischsprachigen Version dieses Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Verstärker | |
| Digidata 1200 Schnittstelle | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oszilloskop TDS430A | Tektronix | Analoges Oszilloskop | |
| Photostimulator PS33 Plus | Graslampenabzieher | ||
| PC-100 | Narishige | Mikropipettenabzieher Abzieher | |
| P-97 | Sutter Instruments | Mikropipette Abzieher | |
| Glaskapillarrohr Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0,8, 1,10, 100 mm |
| HS-2 Kopftisch | Axon Instruments Inc | Kopftisch | |
| Mikromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanischer Mikromanipulator | |
| Stereoskopisches Mikroskop | Zeiss | Mikroskop | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Datenerfassungssoftware für digidata 1200-Schnittstelle | |
| Clampfit | Axon Instruments, Inc | Analysesoftware in Verbindung mit pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Software zur Datenanalyse und grafischen | |
| Darstellung Natriumchlorid | Sigma | S7653 | >99,5 % |
| Kaliumchlorid | Sigma | P-9333 | Mindestens 99 % |
| Magnesiumsulfat | Sigma | M7506 | Mindestens 99,5 % |
| Calciumchlorid | Sigma | C5080 | Mindestens 99,0 % |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99,5 % |
| Natriumhydroxid | Sigma | S8045 | 98,00% |
| Natriumhypochloritlösung | Sigma | 425044 | Verfügbares Chlor, 10-15% |
Referenzen
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
