अपूतित ढीला में CoCrMo कणों के लिए जोखिम से एक Murine Calvarial Osteolysis मॉडल का निर्माण और मूल्यांकन
Summary
इस पांडुलिपि CoCrMo कणों, जो पहनने के कणों और अपूतित ढीला में विभिंन कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक आदर्श पशु मॉडल का गठन के लिए जोखिम से एक murine calvarial osteolysis मॉडल का वर्णन ।
Abstract
कण-प्रेरित osteolysis पहनना संधिसंधान विफलता में अपूतित ढीला का एक प्रमुख कारण है, लेकिन अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट बनी हुई है । पता लगाने और छिटपुट घटना के लिए आवश्यक लंबे अनुवर्ती अप करने के लिए कारण, यह नैदानिक मामलों में रोगजनन ofparticle-प्रेरित osteolysis का आकलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. इसलिए, इष्टतम पशु मॉडल आगे की पढ़ाई के लिए आवश्यक हैं । CoCrMo कणों को एक्सपोजर द्वारा स्थापित calvarial osteolysis के murine मॉडल अपूतित ढीला में कणों और विभिन्न कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रभावी और मान्य उपकरण है. इस मॉडल में, CoCrMo कणों पहले उच्च वैक्यूम तीन इलेक्ट्रोड प्रत्यक्ष वर्तमान द्वारा प्राप्त किया गया और फास्फेट में reसस्पैंड-बफर खारा ५० मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर । उसके बाद, परिणामी निलंबन के ५० µ l murine calvaria के बीच में तीव्र विच्छेदन द्वारा कपाल periosteum के पृथक्करण के बाद लागू किया गया था । दो सप्ताह के बाद, चूहों की बलि दी गई, और calvaria नमूनों को काटा गया; गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन hematoxylin और eosin धुंधला और माइक्रो गणना टोमोग्राफी द्वारा प्रदर्शन किया गया । इस मॉडल की ताकत प्रक्रिया सादगी, हड्डी हानि की मात्रात्मक मूल्यांकन, osteolysis विकास की तेजी, संभावित उपयोग ट्रांसजेनिक या नॉकआउट मॉडल, और एक अपेक्षाकृत कम लागत में शामिल हैं । हालांकि, इस मॉडल को यांत्रिक बल और अपूतित ढीला में कणों के जीर्ण प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । Murine calvarial osteolysis मॉडल CoCrMo कणों के लिए जोखिम से उत्पन्न पहनें कणों और विभिन्न कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है, जैसे, मैक्रोफेज, fibroblasts, osteoblasts और osteoclasts, अपूतित ढीला में.
Introduction
अपूतित ढीला कुल हिप संधिसंधान (THA) और कुल घुटने संधिसंधान (TKA) विफलता का सबसे आम कारण है, जो संशोधन सर्जरी1की आवश्यकता है । हालांकि, अंतर्निहित व्यवस्था अस्पष्ट है2। एक लंबे समय अनुवर्ती कण प्रेरित osteolysis, जिसकी घटना दुर्लभ है का पता लगाने के लिए आवश्यक है; इसलिए, यह नैदानिक मामलों में अपनी रोगजनन का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, आगे के अध्ययन जटिल सेलुलर और ऊतक तंत्र पर ध्यान केंद्रित पहनते कण-प्रेरित osteolysis मॉडल में vivo प्रयोगों में दोनों की आवश्यकता होती है और इन विट्रो में कोशिकाओं में अस्थि homeostasis3से संबंधित परख । एक वैध पशु मॉडल हड्डी हानि पर पहनने के कणों के प्रभाव को उजागर करने में महत्वपूर्ण है, आगे सेलुलर परख के लिए सबूत उपलब्ध कराने ।
एक murine calvarial osteolysis मॉडल CoCrMo कणों के लिए जोखिम द्वारा निर्माण एक प्रभावी और वैध अपूतित ढीला में कणों और विभिन्न कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए विधि है । इस मॉडल में, CoCrMo कणों मैक्रोफेज में भड़काऊ साइटोकिंस उत्प्रेरण द्वारा calvarial osteolysis कारण, osteoclasts सक्रिय, बाधा osteoblast प्रसार, और osteoblast apoptosis को बढ़ावा देने के.
यह केवल इस मॉडल को स्थापित करने के लिए दो सप्ताह लगते हैं । Osteolysis visualized किया जा सकता है और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला और माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) द्वारा quantified2। इसके अलावा, इस मॉडल एक अपेक्षाकृत कम लागत है, और ट्रांसजेनिक और नॉकआउट माउस मॉडल विभिन्न खुराकों पर यौगिकों की एक बड़ी संख्या में स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है3.
प्रक्रिया स्थापित करने और इस मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए सरल है । सबसे पहले, CoCrMo कणों द्वारा प्राप्त किए गए उच्च वैक्यूम तीन इलेक्ट्रोड प्रत्यक्ष वर्तमान और फॉस्फेट में reसस्पैंड-बफर खारा (पंजाब) ५० मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर । उसके बाद, परिणामी निलंबन के ५० µ l murine calvaria के बीच में तीव्र विच्छेदन द्वारा कपाल periosteum के पृथक्करण के बाद लागू किया गया था । दो सप्ताह के बाद चूहों की बलि दी गई, और calvaria नमूनों को काटा गया; गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण एच एंड ई धुंधला andmicro-सीटी द्वारा प्रदर्शन किया गया ।
एक murine calvarial osteolysis मॉडल CoCrMo कणों के लिए जोखिम द्वारा निर्मित CoCrMo ढीला में मैक्रोफेज कणों और जैसे fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, और अपूतित के रूप में विभिन्न कोशिकाओं, के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूहों में पहनने के कण-प्रेरित osteolysis के लिए दो मुख्य तरीके हैं: हवा-पाउच मॉडल और calvarial osteolysis मॉडल । हवा में थैली मॉडल, एक चमड़े के नीचे जनित हवा-थैली पहले की स्थापना की है, पहनने के बाद कण परिचय और अस्थि ऊतक में आर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (८१५७२१११), नैदानिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना फाउंडेशन Jiangsu प्रांत (BL2012002), नानजिंग के वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना (२०१४०२००७), प्राकृतिक विज्ञान Jiangsu प्रांत (BK20161385), और चीनी चिकित्सा डॉक्टर एसोसिएशन (2015COS0810) की विशेष नींव की नींव ।
Materials
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
