Прижизненной микроскопии Моноцит самонаведения и связанных с опухоли ангиогенеза в мышиных модели болезнь периферических артерий
Summary
Моноциты являются важными посредниками arteriogenesis в контексте болезнь периферических артерий. С помощью базальной мембраны как матрица и прижизненной микроскопии, этот протокол расследует Моноцит самонаведения и связанных с ними опухоли ангиогенеза после инъекции Моноцит в бедренной артерии лигирование мышиных модели.
Abstract
Терапевтические цель для периферической артериальной болезни и ишемической болезни сердца является увеличить приток крови к ишемической районах, вызванные гемодинамики стенозом. Сосудистая хирургия является жизнеспособным вариантом в отдельных случаях, но для пациентов без показания для операции, такие как прогрессии для отдыха боль, ишемии нижних конечностей или крупных срывов для жизни и работы, существует несколько возможностей для смягчения их болезни. Клеточная терапия через Моноцит повышенной перфузии путем стимулирования обеспечения формирования является одним из нескольких неинвазивные вариантов.
Наша группа рассматривает arteriogenesis после трансплантации Моноцит в мышей, с использованием модели ишемии задних конечностей. Ранее мы продемонстрировали улучшение перфузии задних конечностей с использованием столбняка стимулирует сингенных Моноцит трансплантации. Помимо последствий для обеспечения формирования роста опухоли могут быть затронуты этой терапии. Расследовать эти эффекты, мы используем базальной мембраны как матричная модель мыши путем впрыскивать внеклеточного матрикса саркомы Engelbreth-холм-Рой в бочку мыши, после окклюзии бедренной артерии.
После исследования искусственных опухоли мы используем прижизненной микроскопии для изучения в vivo опухоли ангиогенеза и Моноцит самонаведения в залог артерий. Предыдущие исследования описал гистологическом Животные модели, которая предполагает последующий анализ в посмертный артефактов. Наш подход визуализирует Моноцит самонаведения районы обеспечение в режиме реального времени последовательностей, легко выполнить и исследует процесс arteriogenesis и опухоли ангиогенеза в естественных условиях.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемической болезни сердца или болезнь периферических артерий, являются наиболее распространенными причинами смерти во всем мире1. Клеточная терапия-это перспективный подход для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, особенно для людей, которые не могут пройти хирургических вмешательств. Существует несколько подходов для использования ячеек или их выделяется веществ как терапевтическое средство2,3, с учетом общей цели улучшения перфузии и поддерживать функции ишемического и underperfused ткани. Одна попытка достичь этой цели – улучшить arteriogenesis, который стимулирует развитие залога артерий. Моноциты являются важным ячейки тип, связанный с обеспечение. Наша группа была сосредоточена на изучение последствий моноцитов в области воспаления4,5, в частности с помощью модели ишемии задних конечностей вызывают ишемию и последующего воспаление6. Моноциты дома в области воспаления и вызвать сложные системные ответы, которые приводят к развитию обеспечение7.
С использованием прижизненной микроскопии мы можем изучить поведение этих клеток в естественных условиях и наблюдать самонаведения вводят моноцитов в области воспаления. Большинство бывших исследования только описывают посмертное анализов, которые держат недостатки, включая введение гистологические артефакты и большое количество животных, необходимых для подготовки. С нашим подходом мы можем исследовать иммунологических процессов и обеспечения формирования через жить изображений в нескольких точках времени.
Помимо разработки сопутствующего артерий в ишемических зонах моноцитов также влияют на рост опухоли. Для расследования этих процессов, мы придать базальной мембраны как матрица, извлеченные из Engelbreth-холм-Рой мыши саркомы, опухоли богаты белков внеклеточного матрикса8и анализировать с помощью прижизненной микроскопии. Эта матрица используется для экрана теста молекул для формирования сети эндотелиальных клеток или противораковых терапий путем ингибирования ангиогенных; в этом случае мы будем оценивать потенциал ангиогенных опухоли моноцитов клетки терапии9,10,11.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации простой и эффективный способ изучения иммунологических процессов, вызванных ишемии в модели в естественных условиях . Мы можем создавать более реалистичные тестовой среде по сравнению с гистологическим реакционной посмертное мышечной ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь проливает свет на развитие залога артерий, поведение моноцитов в этих судов и процесс arteriogenesis. Шаги для применения этого протокола, легко учиться и может использоваться в других областях науки. Несмотря на эти преимущества есть некоторые недостатки. К примеру мик…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ELSE-Kröner-Stiftung и DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Немецкий исследовательский фонд) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, совместный исследовательский центр). Особая благодарность Ханс-Хольгер Гёртнер, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke университет Магдебург, Магдебург, Германия, для технической поддержки.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
