Endringer i den muntlige microbiome i barndommen er av økende interesse. Sammenligning av ulike microbiome studier avslører mangelen på standardiserte Prøvetaking protokoller. Begrenset plass gjør prøvetaking lyd subgingival sulcus av barn utfordrende. Papir punktet prøvetaking er presentert her i detalj som metoden for valg for dette området.
Muntlig biofilm og molekylære analyse gir grunnlag for å undersøke ulike tannlege forskning og klinisk spørsmål. Kunnskap om biofilm komposisjon fører til en bedre forståelse av cariogenic og periopathogenic. Mikrobiell endringer som skjer i munnhulen i løpet av barndommen er av interesse for flere grunner. Utviklingen av barn muntlig bakterieflora og endringer i komposisjonen må analyseres videre for å forstå og muligens hindre utbruddet av sykdommen. Samtidig, er avansert kunnskap om den naturlige sammensetningen av muntlig biofilm nødvendig. Tidlige stadier av karies uten permanent dentition med sunn tannkjøtt gir et mye upåvirket subgingival habitat som kan tjene som en i situ baseline for å studere oral helse og sykdom. Analyse av barns muntlig biofilm under ulike stadier i livet er dermed et viktig tema i feltet. Moderne molekylær analyseteknologi gir omfattende informasjon om bakteriell mangfoldet av slike biofilm. For å aktivere bakterieflora sammenligning av data, er det viktig å standardisere hvert trinn i prosedyren for molekylære data generasjon. Denne prosedyren spenner fra klinisk prøvetaking, neste generasjons sekvensering (NGS), bioinformatic databehandling til taksonomisk tolkning. En av de mest kritiske faktorene her er biofilm prøvetaking. Prøvetaking i barn er enda mer utfordrende spesielt på grunn av begrenset plass i subgingival områder. Derfor fokuserer vi på bruk av papir poeng for subgingival prøvetaking. Denne artikkelen inneholder en detaljert protokoll for muntlig biofilm prøvetaking av subgingival sulcus, mucosa og spytt i barn.
Human muntlige biofilm består av et bredt fellesskap bestående hovedsakelig av commensals og gunstig mikroorganismer1,2,3. Arter her kolonisere alle nisjer at munnhulen tilbyr4,5,6. Biofilm komposisjon i disse nisjene varierer så bredt som habitatene. Spytt viser for eksempel forskjellige bakteriell profiler enn plakk prøver. I plakk prøver av friske voksne er den relative overfloden av Actinobacteria over 20%, mens mindre enn 7% er funnet i spytt. Bacteroidetes og Firmicutes vises i kontrast i mye høyere tall i spytt7. Derfor er det viktig å prøve på forskjellige steder i munnen for å få hele bildet. I tillegg gjør ulike faktorer som geografisk og etniske forskjeller, alder, kjønn og mange andre faktorer det vanskelig å identifisere generelle regler for biofilm utvikling og sykdom utbruddet8,9. I mange år har etterforskningen av periopathogenic og cariogenic biofilm vært en sentral bekymring8,10,11,12,13.
De siste årene fått forskning på friske betydning ikke bare for en bredere forståelse av sykdom, men også for gjennomføringen av forebyggende tiltak14. Nye teknologier og molekylære analyser ytterligere belyse muntlig biofilm dannes og funksjon15,16, og aktiverer komplett profilering av mikrobielle mangfold17,18. Forventes også føre til en ny forståelse av mikrobielle endringer under ortodontiske behandling19. Innvirkning på utviklingen av ortodontiske biologisk materiale er overskuelig. Forbedret perspektivet vil kaste nytt lys over komplikasjoner av ortodontiske behandling tilknyttet biofilm, som emalje demineralisering og periodontal sykdommer12,20,21. For å tillate verdensomspennende data sammenligninger, er det avgjørende å standardisere alle trinnene i data generasjon. Mindre endringer i laboratorium prosedyrer kan sterkt påvirke resultatene. I tillegg kan bruk av varierende beregningsorientert plattformer i databehandling føre til ikke-sammenlignbare datasett. Endelig har valg av statistiske tester og rettelser en innflytelse på resultatene. Men prøvetaking skjevhet kan allerede oppstå lenge før noen laboratoriearbeid eller bio-computing begynner. Ikke standardiserte Prøvetaking metoder føre til en iboende partisk studie. I lys av lav til moderat nivåer for standardisering i de relevante studiene finnes lite bevis på forholdet mellom kjeveortopedi og microbiomes19. Derfor vil utviklingen av standardiserte metoder lette kvalifiserte sammenligning av dataene i feltet.
Denne artikkelen presenterer standardisert muntlig biofilm utvalgstrekking. Protokollen er ment å bidra til å generere globalt sammenlignbare samlinger av mikrobielle sekvens databehandling. En trinnvis protokoll for muntlig biofilm prøvetaking i friske barn presenteres. Metoden valgfrihet er papir poeng satt inn atraumatically inn i lyden subgingival sulcus. For å lette habitat sammenligninger, Samples kinnet mucosa etter samme protokoll. Denne artikkelen viser i tillegg parallelle og grupperte prøvetaking. Videre vises saliva prøving. En enkel fargekodet transport og lagringssystem er også presentert, tilrettelegge prøven ledelse for videre behandling. Valg av nedstrømsvirksomhet om lagringsmedium, metagenomic analyser og bioinformatikk avhenger av klinisk spørsmålene fra ulike felt i muntlig forskning. I dette manuskriptet har DNA prøvetaking for NGS blitt valgt som et eksempel av en mulig for ortodontiske forskning.
Bakterier er funnet på alle områdene i munnhulen24,25,26. Mange studier har fokusert på bruk av spytt som prøvetaking medium tilordne muntlig kolonisering som det lett kan bli samplet gjennom spytter27,28,29,30,31, 32. Salivary biofilm gjenspeiler imidlertid ikke subgingival biofilm komposisjon. Dermed bruk av andre Prøvetaking metoder er avgjørende for å lage hele bildet, og vil fremkalle nye diskusjoner i dental forskning. Flere artikler sammenligne bruken av curettes og papir poeng for subgingival utvalg av periodontally syke fag8,33,34. Ingen forskningsgruppe kjent ennå har fokusert på anvendelse av standardiserte prøvetaking enheter for ulike aldersgrupper, spesielt for barn19.
I denne videoen presenteres muntlig biofilm utvalg av tre muntlig habitater på friske barn.
Endringer og feilsøking:
Målet med manuskriptet fokuserer på klinisk protokollen for subgingival biofilm utvalg av friske barn. Metoden for valg refererer til lyd subgingival sulci der begrenset plass gjør prøvetaking spesielt utfordrende. I denne videoen ble metoden brukt til tidlig permanent dentition. Det kan også brukes til å blandet eller eldre dentition og barn og/eller voksne. Våre sampling metoden gjør endringer som enkelt-eller gruppert. Sistnevnte kan bli en avgjørende faktor for molekylær analyser på grunn av den lille mengden av DNA collectable fra den sunn subgingival sulcus. Valg av indeks tennene kan endres etter behov. en annen tann kan spesielt være samplet som et alternativ når epitel er traumatisert og blødning, dermed papir poenget ubrukelig. Parallell prøvetaking bruke to papir poeng samtidig på ett nettsted gjengir eksempel replikat i ett trinn, i tillegg til raskere stol tid for barn.
Med små modifikasjoner kan syke og minsker lommer samplet. Her må papir poeng settes til hele lengden av lommen, som kan nå opp til 10 mm. Lengden og conus papir poeng og dybden av innsetting må tilpasses intraoral habitat rundt, men bør alltid være standardiserte av materialer og dimensjoner. Eksempler kan også hentes fra mucosa bruker papir poeng. Identiske protokoller gjør sammenligninger av ulike muntlige habitater og ulike tannlege materialer. Pasienten forberedelse og prøve lagring kan utføres som beskrevet i denne videoen. For metatranscriptome forskning, kan RNA prøves med samme metode. Dermed etter prøvetaking, skal papir punktene settes inn direkte i RNA stabilisering løsning.
Begrensninger av teknikken:
Uansett modifikasjoner er klinisk sampling metoden vi beskriver begrenset til den lyd subgingival sulcus. Andre målestasjoner, som for eksempel periodontally syke lommer, var ikke en del av vår studie. Prøvetaking til full dybden av slike lommer er nødvendig papir poeng kan ikke være stor nok til å samle inn eksempler tilstrekkelig. Hvis eksperimentelle målet er å sammenligne data samplet lyd subgingival sulci og periodontally syke lommer, er det viktig å være klar over det iboende skjevhet som er knyttet til forskjellige kliniske Prøvetaking metoder. Det derfor er ikke tilrådelig å sammenligne slike data.
En begrensning av metoden presenteres her prøvetaking uten påfølgende bruk av propidium monoazide. Legger til denne agenten direkte etter prøvetaking gir konkrete analyser bare levende cellene i biofilm analysert. Sampling metoden beskrevet her gjenspeiler antall levende og døde celler. For forskning av alvorlig periodontitt må papir poeng sannsynligvis erstattes av curettes, biofilm formasjon i dype lommer er sterk. Papir punktet prøvetaking ikke kanskje reflektere hele mikrobiell spekteret i disse tilfellene som deres overflaten kan være mettet for fort.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder:
Foreslåtte manuskriptet er først av sitt slag å standardisere subgingival prøvetaking i den sunne sulcus med papir poeng. Andre rapporter har referert til bruk av metall curettes35,36 eller papir poeng 37,38,39, men ikke beskrive prosessene som finner sted før prøvetaking, slik plakk kontroll, tann rensning, tann isolasjon og tørking, og prosessene som skyldes utilstrekkelig spesifikasjoner på prøvetaking teknikk og tid linjer.
I to tidligere artikler viser vi at bruk av papir poeng er en reproduserbar metode for subgingival biofilm prøvetaking i barn22,40. På grunn av deres design er curettes for stor for den grunne sulcus med begrenset plass og også skarp for anbudet junctional epitel. Det er avgjørende å adgang det subgingival sulcus uten traumatisk epitel. På denne måten unngås skjevhet som følge av blødning. Dermed er bruk av slim og ømme punkter foretrukket for dette området. Papir er funksjonell å overvåke endringer i biofilm komposisjon under ortodontiske behandling21,41. De er slank og fleksibel nok til å passe mellom elementene i faste ortodontiske apparater. Dette er en stor fordel til andre Prøvetaking metoder som curettes. Atraumatiske prøvetaking er forenklet og utvalg av små mengder DNA er mulig.
Fremtidige programmer:
I denne videoen viste vi metoden på ikke-syke, tidlig, permanente dentition. Det kan også brukes på blandet eller eldre dentition. Med en er det mulig å prøve periodontally syke nettsteder som tenner eller implantater og andre nisjer på grunn av dentale materialer ved å følge samme protokoll. Karies forskning kan ha nytte av denne standardisert protokollen, i bestemt studier på roten tannråte. Den viktigste foredraget fra våre prøvetaking video er standardisering av protokoller for å gjøre data tilsvarende, uansett hva og hvordan prøver måles.Fremtidige video demonstrasjoner kan styrke feltet av klinisk prøvetakingen generelt.
Muntlig biofilm oppnås som vist i videoen brukes i klinikker og vitenskapelige undersøkelser. Denne i vivo representerer et godt tillegg til i vitro molekylær teknikker som fluorescens i situ hybridisering og AC confocal mikroskopi15for laserskanning. NGS metoder, tillate som pyrosequencing vist her, brukes den innsamlede biofilm, analyse av den komplette bakterieflora. Beregne den relative abundances av enkelte bakterielle arter kan brukes til å støtte behandlinger eller sammenligne pasienter eller forskjellige behandlinger. Sammen med en standardisert sekvensering protokollen og rekkefølgen analyse arbeidsflyt som vi har tidligere beskrevet40, denne sampling metoden tillater sekvens analyse ned til slekten nivå. Videre “meta”-studier som metatranscriptomic eller metabolomic studier er mulig basert på prøvetaking protokollen presentert i denne videoen.
Avgjørende skritt:
Unngå forurensning er et kritisk punkt: sterile instrumenter må installeres i et ikke-sterilt i vivo -miljø. Overføring fra munnen til benken må utføres raskt og sikkert av en erfaren sensor å holde stol tid for deltagerne så kort som mulig. Det viktigste trinnet i protokollen er atraumatiske innsetting av papir poenget inn den subgingival sulcus. Avbrudd i junctional epitel og blødning absolutt må unngås. Ytterligere omsorg må tas for å ikke forurense papir poeng og lagring ampuller med eksogene DNA eller RNA. Lagring seg deretter er også et avgjørende skritt. Prøvene skal fryses direkte, i beste fall på −80 ° C. Dette unngår endringer i bakteriell komposisjon innlegget sampling, noe som ville forfalske sekvensering resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlig til Joachim Theussl (Center for medisinsk forskning, medisinske universitet av Graz) for utmerket teknisk assistanse i video produksjon og Monica Farrell (Research Management, medisinske universitet av Graz) som tale talent.
Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |