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Articolo metodologico

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

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DOI:

10.3791/56325

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12 ottobre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un'analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.

Abstract

Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l'aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l'interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi).

Introduzione

Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo1,2. Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi1,2. Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL1,2, il meccanismo con cui HDL attenua l'inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso 3,4. Così, è stato suggerito che la complessa struttura e la funzione di assoluto livello di HDL piuttosto che può prevedere più accuratamente aterosclerosi 5,6,7,8. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Questi i) ridurre le potenziali efflusso di colesterolo 9, ii) diminuire anti-infiammatori e aumentare HDL-collegati di proteine pro-infiammatorie 6,7, iii) ridurre i livelli di fattore antiossidante e attività e HDL capacità di inibire l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDLox)10 e iv) aumentare del lipido del perossido d'idrogeno contenuto e redox attività (HDLox)9,11. Saggi di robusti che valutano le funzioni di pleotropic di HDL (ad esempio di efflusso di colesterolo, funzione antiossidante) possono complementare determinazione del HDL-HDL-C nella clinica.

La funzione di HDL è solitamente valutata dai metodi basati su cellule quali il colesterolo efflusso dosaggio8,12,13,14. Questi metodi hanno limiti principali tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi 7,15. Questi inconvenienti pongono difficoltà per grandi studi clinici16. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. L'efflusso di colesterolo è una delle funzioni più importanti di HDL, ma può essere determinato solo da analisi cell-based. Altri approcci per determinare la funzione di HDL come proteomica17,18,19,20,21,22,23, 24 e chemiotassi del monocito basati su cellule di HDL funzione 17,22,25 non sono state standardizzate e non può essere utilizzati negli studi umani su larga scala.

HDL ha antiossidanti significative atheroprotective effetto5,6,7,8. La funzione antiossidante di HDL è stata determinata in presenza di LDL in precedente cella analisi fluorometriche gratis 26. Questi metodi fluorometrica biochimici della funzione antiossidante di HDL sono stati originariamente sviluppati da Mohamad Navab e Alan Fogelman e loro colleghi26. Anche se molti studi umani hanno utilizzato questi metodi per determinare HDL funzione 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipidi (HDL)-lipidica (LDL) e interazioni lipido-fluorocromo possono limitare la riproducibilità di questi saggi biochimici non enzimatico libero delle cellule del HDL funzione27,28.

L'interesse recente si è concentrata sulle conseguenze funzionali dell'ossidazione di HDL che è il risultato dell'ossidazione di lipidi e di proteine all'interno di HDL 27,29,30. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ossidazione di HDL altera HDL funzione 27,29,30. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Così il contenuto di perossido lipidico HDL può essere utilizzato per determinare HDL funzione 9,17,20,31 e dato le limitazioni note di analisi preventiva di HDL funzione7, 15,27,32, abbiamo sviluppato un metodo fluorimetrico alternativo che quantifica HDL lipidi perossido contenuto (HDLox) 32. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C 32. Il principio biochimico del dosaggio è mostrato nella Figura 1. Abbiamo dimostrato che questo approccio basato sulla fluorescenza non ha le limitazioni del precedente HDL funzione saggi27,28. Questo test è stato ulteriormente affinato e standardizzato nel nostro laboratorio in modo che può essere utilizzato in modo affidabile negli studi umani su larga scala anche con crioconservati plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive della malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. qui, Descriviamo questo metodo semplice, ma robusto per misurare il contenuto di perossido lipidico di HDL (HDLox). Questo test utilizzabile come strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi)32.

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Protocollo

tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con l'approvazione di etica presso l'Università di California Los Angeles, Los Angeles e il Comitato di etica umana di Alfred Hospital, Melbourne.

Nota: ci sono molte variazioni della funzione fluorocromo HDL Assay (Vedi la discussione) 32. Qui di seguito descriviamo il protocollo che dà i risultati più coerenti e riproducibili. Una panoramica del test è illustrata nella Figura 2.

1. esemplare lavorazione

  1. uso fresco, non emolizzato (possono essere raccolti in provette separazione siero) del siero o plasma citrato ottenuto dopo 12-14 ore di digiuno. Se utilizza campioni crioconservati, includere il controllo appropriato come descritto in questo protocollo.

2. Giorno 0-preparazione per l'analisi

  1. preparare layout di lavoro di esperimento con gli opportuni controlli, campioni e replica. Eseguire almeno ogni esempio in triplici copie. Un rappresentante 96 ben layout è illustrato nella Figura 3.
  2. Calcolare tutti i volumi dei reagenti che verranno utilizzati per il dosaggio basato sul numero di campioni e replicati.
    Nota: Includere un volume supplementare di 10% in ogni magazzino di lavoro per assicurarsi che ci sia abbastanza volume per ciascun reagente per l'esperimento specifico.
  3. Provette obbligatori per tutte le diverse fasi del dosaggio ad es. per la separazione di HDL, misura di HDL-C (opzionale) e il fluorochromeassay.

3. Giorno 1-la preparazione dei controlli

  1. preparazione del controllo pool specifici dello studio
    1. Crea un campione di controllo da pool di plasma o siero di studio tutti i campioni. Se in esecuzione 20 campioni in ogni piatto in triplice copia, è possibile combinare 10 µ l di ogni campione in un controllo di 200 µ l in pool. Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo.
      Nota: Utilizzare questo controllo in pool per standardizzare il dosaggio e conto per tutti i possibili noto (ad esempio tipo di siero di matrice rispetto al plasma, cicli di gelo-disgelo, crioconservazione) e sconosciuti fattori di confondimento che possono influenzare la variabilità sperimentale 27 , 28.
  2. Preparazione di specifici del laboratorio controllo qualità (QCs)
    1. preparare un grande magazzino di HDL in ciascun laboratorio (ad esempio HDL isolato da 5 mL di plasma di donatori sani 10) e crioconservare diverse aliquote di questo magazzino per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo.
    2. Uso almeno 10 diversi replica da questo stock per determinare il valore medio di HDLox. Una gamma accettabile di HDLox misurato valori per ciascun campione QC incluso in ogni dosaggio è all'interno di < 15% del coefficiente di variazione di questo valore medio.
    3. Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo (es. 40 mg/dL).
      Nota: Un approccio dettagliato come utilizzare sangue da banche del sangue per creare questi controlli è stato precedentemente descritto 27 , 28 , 32. Utilizzare ulteriori QCs come necessario (per esempio uno da un donatore sano, noto per avere la funzione di HDL normale e uno da un donatore conosciuto per avere la funzione di HDL in gran parte anormale.
  3. Ottimizzazione del segnale di fondo e valori vuoti (opzionali)
    1. per ridurre al minimo di sfondo, aggiungere la quantità appropriata di catalasi (1-4 U/mL) nel medium di incubazione per rimuovere rapidamente il formato di H 2 O 2 a causa di ossidazione spontanea aria dei buffer.
      Nota: Poiché i valori dai pozzetti vuoti (nessun HDL) sono essere sottratti dai valori dei campioni HDL e i risultati sono stati segnalati rispetto a un controllo in pool (che è incluso nello stesso piatto ben 96), abbiamo trovato che questo passaggio non praticamente non applicar t i risultati. Così, ottimizzazione del segnale sfondo con catalasi può essere omesso, se necessario.

4. Giorno 1-separazione di HDL colesterolo usando la precipitazione di HDL

Nota: utilizzare un reagente precipitante di HDL colesterolo standardizzato commercialmente disponibile per isolare apoB impoverito siero secondo il produttore ' s istruzioni. Questi reagenti sono ampiamente usati in saggi colorimetrici per determinare i livelli di colesterolo di HDL.

  1. Fresca (o sbloccare) campione di plasma o siero.
  2. Mescolare volumi uguali (per esempio 80 µ l) di plasma e reagente precipitante colesterolo di HDL (20% w/v polietilene glicole in tampone di glicina a pH 10,0 (25 ° C)).
  3. Mix ben pipettando su e giù.
  4. Centrifugare a 1000-2000 x g per 10 min.
  5. Aspirare il supernatante (frazione di HDL).
  6. Idealmente utilizzare immediatamente l'HDL isolato per il fluorochromeassay di perossidazione lipidica di HDL. Tuttavia, se parecchi campioni vengono eseguiti nello stesso giorno e altri passi come misura della concentrazione di HDL-colesterolo sono anche fatto, quindi memorizzare l'HDL isolato a 4 ° C e utilizzarlo il giorno successivo per la funzione di fluorochromeHDL Assay.

5. Giorno 1-determinazione di HDL-C a HDL isolato

Nota: questo è facoltativo se il valore di HDL-C da laboratorio clinico è utilizzato per normalizzare HDLox dalla quantità di HDL-C.

  1. Quantificare il HDL-colesterolo da plasma, utilizzando standard colorimetrico dosaggi 27. Aggiungere 50 µ l di reagente di colesterolo in ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione di colesterolo mediante un lettore colorimetrico e un colesterolo standard fornito in ogni kit.

6. Giorno 2-preparazione dei reagenti

  1. preparare HRP e colesterolo soluzioni HRP 5 U/mL di soluzione (gamma 1-10 U/mL).
  2. Preparare 20mm fluorocromo (ad es., Molceular rosso) soluzioni: scongelare un flacone di reagente fluorocromo e DMSO a temperatura ambiente. Prima dell'uso, sciogliere reagente fluorocromo (1 mg) in 200 µ l di DMSO. Conservare la soluzione stock congelati a ≤-20 ° C, al riparo dalla luce.
  3. Preparare i controlli positivi e negativi: uso 1 X ' tampone di reazione ' senza colesterolo e 20 mM H 2 O 2 soluzione di lavoro come controllo positivo e negativo, rispettivamente.

7. Giorno 2-fluorocromo Assay

  1. aggiungere 50 µ l di tampone di reazione come vuoto (controllo negativo) 1x.
  2. Facoltativo: aggiungere la soluzione di lavoro di 20 mM di H 2 O 2 come controllo positivo in ogni piastra.
  3. Per ridurre al minimo la variabilità sperimentale e garantire che l'aggiunta di reagenti e campioni sono fatto costantemente e in modo tempestivo, eseguire tutte le aggiunte di campioni in un separato piastra di ben rotondo-fondo, chiaro, polistirolo o polipropilene 96 (tavola 1). Quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire volumi specifici in 3 piastre da 96 pozzetti (piastre 2-4: bot in polipropilene, casalinghiTom, nero) (che hanno layout identico) ( Figura 2, Figura 3).
    1. , Ad esempio, aggiungere innanzitutto 160 µ l di HDL isolato in ogni pozzo/campione della piastra 1 e poi con l'uso di pipette multicanale trasferire 50 µ l di HDL-colesterolo da ciascun pozzo/campione nelle piastre 96 pozzetti nere. Cambiare suggerimenti tra ogni riga/colonna e utilizzare suggerimenti non filtrata per tutti i trasferimenti.
  4. Lasciare campioni nei pozzetti. Non gettare via. Non ci sono gradini di lavaggio tra aggiunta di reagenti.
  5. Aggiungere 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) in ciascun pozzetto.
    Nota: Uso HRP prima dell'aggiunta del reagente fluorocromo.
  6. Incubare 30 min a 37 ° C. Non gettare via i campioni dopo incubazione (senza fasi di lavaggio tra aggiunte dei reagenti).
  7. Aggiungere 50 µ l di fluorochromereagent per una concentrazione finale di 300 µM. A questo punto, volume di reazione totale è di 150 µ l. mescolare bene e proteggere dalla luce.
  8. Valutare la lettura fluorescente (nel buio) ogni minuto oltre 120 min a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm).
    Nota: Utilizzare un intervallo di 60 minuti più breve con campioni freschi. Abbiamo trovato quel dosaggio di 120 minuti dà più dati riproducibili con l'uso di campioni crioconservati.
  9. Registrare i dati utilizzando il software appropriato.

8. Giorno 3-analisi dei dati

  1. registrare unità di fluorescenza (unità arbitrarie) a 120 minuti dopo l'aggiunta del fluorocromo reagente per tutti i campioni compresi pozzetti del bianco e tutti i controlli.
  2. Calcolare il valore medio delle unità di fluorescenza (basato su almeno triplicates) (HDL ox_sample). Non assumere valori erratici (> 2 SDs dal valore medio) in considerazione.
  3. Sottrarre alla fluorescenza di fondo utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
  4. normalizzazione per la quantità di colesterolo HDL (HDL-C): normalizzare il valore di perossidazione lipidica di HDLox per ogni campione (incluso il controllo pool) di HDL-C) (mg/dl). In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come n (HDL-C) HDLox misura per riflettere la regolazione per HDL-C. Utilizzare la seguente equazione:
    figure-protocol-2
  5. standardizzare l'espressione del valore di perossidazione lipidica HDLox di ciascun campione contro il valore di un controllo in pool. Normalizzare la n (HDL-C) HDLox del lipido perossidazione valore per ogni campione (regolato per HDL-C) di n (HDL-C) HDLox valore di perossidazione lipidica del controllo in pool. In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come misura di bue nHDL per riflettere la regolazione per la variabilità sperimentale e HDL-C. Utilizzare la seguente equazione:
    figure-protocol-3
    Nota: questo approccio è simile ad altri approcci sperimentali stabiliti di ridurre la variabilità sperimentale delle misurazioni come International normalized ratio (INR) 44 , 45. Questo approccio è stato validato in studi clinici 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando campioni di controllo di qualità standard. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri controlli di qualità (QCs). Idealmente, c'è un QC per nHDLox da un campione con noti HDL disfunzionali e un QC per nHDLox da un campione da donatori sani [ad es. uso campione da giovani adulti che sono stabiliti banca del sangue di donatori e non hanno conosciuto comorbidità e fattori di rischio per malattia cardiovascolare compreso il fumo]. Il controllo di quest'ultimo standardizza risultati tra i diversi laboratori. I valori medi di questi QCs sono stabiliti sulla base almeno 5 replicati (in genere si usa 10 replicati per questo importante passo).
    1. Check se misurato QCs in ogni dosaggio hanno valori entro l'intervallo di valori previsto. Supponendo che un'accettabile massima variabilità sperimentale del 15%, tutti i valori sperimentali misurati dovrebbero rientrare nel 15% dei valori medi noti di QC stabiliti. Utilizzare le seguenti equazioni:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Nota: se sia il controllo di qualità incluso campioni ( normali rispetto alle HDL disfunzionali) dà HDLox valori fuori intervallo previsto (stabilito in ciascun laboratorio) poi ripetere l'esperimento.
  7. Eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando il coefficiente di variazione (CV) per quantificare la variabilità sperimentale: ripetere tutti i campioni con CV % > 15%. Utilizzare la seguente equazione:
    figure-protocol-6
    Nota: un tipico intra-dosaggio (all'interno della placca stessa) e la variabilità sperimentale Inter-saggio (tra piastre differenti) è < 15%. 2) un tipico CV intra-assay è tra 1-7% e un tipico interassay CV è tra 3-10%.

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Risultati

In tutti i pozzetti come al punto 7.3 vengono aggiunti 50 µ l di ciascun campione di HDL. 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.5. I campioni sono incubati per 30 min a 37 ° C come descritto al punto 7.6. 50 µ l di reagente fluorocromo vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.7 (concentrazione finale di 300 µM). La lettura fluorescente (nel buio) è quindi valutata ogni minuto oltre 120 minuti a 37 ° C con ...

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Discussione

Il protocollo descritto qui offre un robusto strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nell'aterosclerosi e nella malattia umana. Il dosaggio quantifica il contenuto di perossido lipidico HDL per mg di HDL-C usando amplificazione enzimatica (HRP). Questo approccio evita limitazioni note di saggi per la funzione di HDL preventiva (ad es. il saggio di efflusso di colesterolo) tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzat...

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Dichiarazioni

Questo protocollo e il dosaggio sono rilevanti per il brevetto PCT/US2015/018147.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro del Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. T.A.A. è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. AJ e AH sono supportati da NHMRC progetto grant 1108792. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti sperimentali
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Reagente precipitantePointe ScientificH7511
Amplex Red.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla luce
DMSO.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla luce
Rafano perossidasi (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla leggera
esterasi del colesterolo.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dal
colesterolo leggero Standard di riferimentoLife Technologies, Grand Island, NYA12216Kit di analisi del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla luce
Resorufin fluorescense Standard di riferimentoLife Technologies, Grand Island, NYA12216Kit di analisi del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla luce
5x Buffer di reazione.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit per il dosaggio del colesterolo rosso Amplex.
• ≤ – 20 gradi C & toro; Essiccato
& toro; Proteggere dalla luce
colesterolo HDL Reagente automatizzatoThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
NameAziendaNumero di catalogoComments
Plasticware
96-well plates (polipropilene, fondo piatto, trasparente).Piastre Sigma AldrichM0687
a 96 pozzetti (polipropilene, fondo piatto, nero).Sigma AldrichM9936
Provette Eppendorf da 1,5 mLEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, sterileThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific Pipette multicanale, 8 canali, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, Stati Uniti.  14-387--955
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Software
Gen5 2.01 softwareBiotek, Vermont, USANA
strong>Name AziendaNumero di catalogoComments
Equipment
Gen5 Lettore di piastreBiotek, Vermont, USANA
il <

Riferimenti

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

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