נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול
Summary
פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.
Abstract
siRNA בתיווך shRNA דפיקה למטה (KD) שיטות של ויסות גנים כלי יקר ערך להבנת תפקוד גנים וחלבונים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, במקרה כי KD של החלבון עניין השפעה קטלנית על תאים או ההשפעה הצפויה של KD שיטות KD תלויי-זמן, אהבה ללא תנאים אינם מתאימים. מערכות מותנה יותר המתאימים במקרים אלה, היה הנושא של עניין רב. אלה כוללים מערכות ביטוי Ecdysone-inducible, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ומוסדרת טטרציקלין מערכות ביטוי גנים.
טטרציקלין מוסדר ג’ין ביטוי המערכת מאפשרת שליטה הפיך על ביטוי חלבון באמצעות אינדוקציה של הביטוי shRNA בנוכחות טטרציקלין. פרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת ט’-על תפקודי בשורות תאים סרטניים אנושיים עבור בקרת מותנה גנים. ואז נדגים את השימוש במערכת זו במחקר של גידול התא-מונוציט אינטראקציה.
Introduction
הגידול הקשורים מקרופאגים (תאמי) תורמים להתפתחות הגידול באמצעות קידום הגידול, גרורות, ויסות התגובה החיסונית2. סרטן תאי ומונוציטים דלקתיות מגויסת, אשר לחדור הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic3. חדירה של הגידול עם תאמי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן, נקשר את התפקיד לדיכוי המערכת החיסונית של מקרופאגים4,5. עם זאת, המנגנון של הגיוס של מקרופאגים לגידול לא נידונות טוב, הבנה טובה יותר של המסלולים המעורבים חיוני לקידום בהמשך השדה, טיפולים המבטיחים. אחד האתגרים ללמוד אינטראקציות בין תאים סרטניים ותאים רגילים ב microenvironment הגידול (טיים) הוא המורכבות של מנגנונים, מעורב, הדורשים גישות במבחנה המאפשרים ניתוח crosstalk תאים. כאן אנו מציגים מתודולוגיה צדדי שניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעה paracrine של סרטן התא, נגזר, חלבון המופרש על הגירה של סוגי תאים אחרים כמו מקרופאגים, במבחנה. באמצעות מערכת איפה הביטוי של shRNA נגד סרטן התא-derived חלבון מעורב בגיוס ומונוציטים תחת השליטה של האמרגן inducible טטרציקלין, הוא quantitated את ההשפעה paracrine של החלבון המופרש על ומונוציטים. ב פרוטוקול זה, שכפול הרצפים shRNA לתוך טטרציקלין וקטור מוסדר מוצג ואחריו לדור של שורות תאים סרטן יציב. עוד, הטיהור ומונוציטים אנושי ראשוני ואת וזמינותו הקאמרית של בוידן משמשים כדי לנתח את ההשפעה paracrine של חלבון תאי סרטן נגזר על העברה של ומונוציטים.
Downregulation של חלבון קידוד גנים מוחל בדרך כלל עם siRNA וטכניקות shRNA, אבל לא בלי מגבלות בשימוש בו. לטווח ארוך הדפיקה למטה (KD) של גנים עשויים להפיק תגובות מסתגלת משני תאים להפריע תוצאות ניסויית. חוסר שליטה טמפורלית על ביטוי גנים מקל מאתגר ללמוד את התפקיד דינמי של חלבון לאורך זמן או את התפקיד של חלבון חשובה לקיום התא. בעיה זו חשובה במיוחד ויוו הגדרות, איפה התפקיד של חלבון התפתחות גידולים והתקדמות עשויים לדרוש את downregulation של הביטוי של החלבון עניין רק לאחר הגידול הוא הוקם. KD מותנה יש את היתרון של מניעת מוקדם מדי קטלני תופעת KD על תאים, וכדי לאפשר ניתוח של תפקידו של החלבון בתוך בשלבים שונים של הגידול, בעוד KD ללא תנאים עלולה לגרום חוסר התפתחות גידולים.
מספר מערכות KD מותנה פותחו כדי לטפל המגבלות של KD יציב. מערכות ביטוי של גנים מותנה כוללים Ecdysone-inducible ביטוי מערכות, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ו טטרציקלין מוסדר מערכות ביטוי גנים. מערכות ביטוי של גנים מוסדר טטרציקלין מאפשרים שליטה על הבעת shRNA על תוספת של אנטיביוטיקה טטרציקלין (או שלה אנלוגי יותר יציב – דוקסיציקלין). ב ט-על מערכות, הביטוי של shRNA מושרה בנוכחות טטרציקלין/דוקסיציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים KD, ואילו במערכות ט-OFF, הביטוי של shRNA מדוכא בנוכחות טטרציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים. החיסרון של מערכת inducible-טטרציקלין הוא שדווחה בעבר רמות נמוכות של ביטוי shRNA בהיעדרו של דוקסיציקלין – כביכול leakiness6,7. ט-מופעל המערכת המתוארות כאן, על הממשל של טטרציקלין, הכריכה של טטרציקלין צורונים ביטוי (טטריס למצוא) בחלבון רצף רכיב (TRE) ט מגיב בתוך H1 הוא אזור יזם shRNA עניין לדכא. התוצאה היא ביטוי של shRNA וניגוד של תרגום של החלבון עניין ב-8,באופן תלוי-טטרציקלין9.
מערכות אחרות-טט-על זמינות לכלול בו זמנית טוק-של TetO רצף בין תיבת טטה רצף proximal רכיב (פסי) ובין תיבת טטה שעתוק להתחיל פותח ע י צ’אן ואח. 10 מערכת זו דורשת פחות רעיל במינונים של טטרציקלין להסדיר ביטוי shRNA, עם זאת, תחת מצב שאינו-induced, רמות נמוכות של shRNA באים לידי ביטוי. Krüppel-הקשורים box (קראב) המבוסס על ט’-על מערכת11 כולל קראב, חלבון אצבע אבץ, אשר נושאים גנים הממוקמים בתוך טווח 3 kb של אתר האיגוד קראב כדי דיכוי גנים ברמת השעתוק. TTRKRAB chimeric חלבון יכול להיקשר TetO, עקב מגוון רחב של יכולת לשליטה דנ א, TetO לא צריך להיות מוגבל בין שעתוק באתר, יזם את ומתחילים יש השפעה נמוכה על הפעילות של האמרגן. תחת המדינה הלא-induced, מערכת לשליטה זו התערבות RNA דווח כדי להציג רמה נמוכה יותר של ביטוי דלף shRNA11,12; עם זאת, זה דורש גישה שיבוט רציפים, שני-וקטור. בהשוואה בעבר מפותחות מערכות KD מותנה כגון Ecdysone-inducible ביטוי המערכת או P-450 ציטוכרום אינדוקציה המערכת, המערכת מוסדר טטרציקלין יש את היתרון של הפיכות בחוסנו, ולכן ביותר בשימוש שגרתי מערכת13. המערכת בשימוש פרוטוקול זה יש יתרון כפול TetO טוק-אין מערכת ומערכת קראב ט-על כמו זה דורש וקטור ישר קדימה, יחיד שיבוט, ומאפשר דור מהירה של שיבוטים מרובים, זה מוצגים רמות נמוכות מאוד של leakiness, היעדרות של דוקסיציקלין.
טיים היא קריטית להתפתחות של סרטן. כדי להקל על הגידול, תאים סרטניים לגייס ומונוציטים דלקתיות על ידי הפרשת חלבונים chemotactic. ומונוציטים מגויס לחדור את הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic שתורמים הגידול של גרורות. מחקרים במבחנה של גיוס תא החיסון לנצל את מבחני ההעברה, עם בוידן assay קאמרית להיות נרחב בשימוש14,15,16,17. ב הזה assay, מקור חלבון chemoattractant, לדוגמה, תאים סרטניים, או חלבון מטוהרים, ממוקם בתחתית המצודה. תאים חיסוניים ממוקמים בחדר העליון מופרדות על-ידי נקבובי ממברנה מ והתא התחתון. תאים נודדות לכיוון מעבר הצבע הגוברת של chemoattractant, ואלה שנמצאו בצד התחתון של הקרום צבעונית, ספרתי מתחת למיקרוסקופ. כאן אנחנו לבדוק את תפקוד chemoattractant Plasminogen Activator מעכב 1 (פאי-1) על ומונוציטים על ידי יצירת שורות תאים סרטן יציב, inducible שבו הביטוי של פאי-1 מוסדר על ידי תוספת דוקסיציקלין. אנו משתמשים ומונוציטים ראשי האדם בוידן קאמרית ההעברה וזמינותו כדי להעריך את התפקיד של פאי-1 בהעברה מונוציט. ההבדלים בין האנושי ומונוציטים ראשי שורות תאים monocytic בשימוש נרחב כמו THP1 דווחו וכוללים דפוסי ביטוי ציטוקינים שונים18; לדוגמה, לעומת 5-10 קיפול עלייה TNF-α רמות הביטוי על ידי תאים THP1 ומונוציטים האנושי19. תאים THP1 נגזרים מתוך תאי סרטן אנושיים monocytic, כדי לשמור על, להתרבות עם ממוצע מכפיל את עצמו בתקופה של 19-50 גובה20. להפך, ומונוציטים האנושי מאופיינים על ידי אורך חיים קצר, בהעדר גורמי גדילה. מאז ומונוציטים וגופם מטוהר מהדם של תורמים, כמות נכבדה של השתנות מתרחשת בין האנשים, בהתאם לשיטת טיהור, זיהום, עם סוגי תאים אחרים עלולה להתרחש. למרות זאת, ומונוציטים ראשיות הרלוונטיות, זה מומלץ להשתמש או לאשר את התוצאות שהושגו עם הקווים תא monocytic באמצעות ומונוציטים הראשית in המחקר הביולוגי19. כאן נתאר פרוטוקול לטיהור של האדם העיקרי ומונוציטים מדם היקפי. שיטות אלטרנטיביות מונוציט טיהור כוללות צפיפות הדרגתי והצמדות פרוטוקולים צעד שני ההליך עם מעברי צבע יחיד של Ficoll-Hypaque ואחריו הדרגתיות Percoll21. הטוהר של האוכלוסייה מונוציט מתקבל על ידי טווחים אלה שיטות בין 70-90%. השיטה המתוארת כאן משתמש הדרגתי צפיפות ואחריו בחירת מערכת החיסון שלילית22 , ומאפשרת הטיהור של monocytes האנושית ללא קשר ישיר עם נוגדנים, ובכך הימנעות שלהם הפעלה בשוגג, וכתוצאה מכך > 95% טהור אוכלוסיית ומונוציטים.
פרוטוקול המובאת כאן משמש להגדרת מערכת ט-אן פונקציונלי של ביטוי גנים KD בשורות תאים סרטניים אנושיים כדי לחקור את האפקט chemoattractant של סרטן, נגזר על ידי החלבון פאי-1 על ומונוציטים. פאי-1 הוא overexpressed על ידי מגוון רחב של גידולים, הביטוי שלה באופן פרדוקסאלי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן23,24. תפקיד פרו-tumorigenic פאי-1 הוא תוצאה של pro-אנגיוגנזה שלה ופונקציות אנטי-מוות25,26. פאי-1 הוכח לתרום דלקת על ידי קידום הגיוס של מקרופאגים לאתר של דלקת27. פאי-1 הוצגה כדי לקדם את שריר חלק cellmigration28,29 ו להשתתף ההעברה מקרופאג התלויים30מק-1. פאי-1 ביטוי הוכח גם לשפר במידה ניכרת את הגיוס של Raw 264.7 מקרופאגים לתוך גידולים מלנומה B16F1031. עם זאת, תפקידו של פאי-1 ב- TAM ההעברה לא נחקר בפירוט. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי לענות על השאלה של פאי-1 מושך ומונוציטים תאים סרטניים. מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח crosstalk בין הגידול טיים על ידי החלבון המופרש של תאים סרטניים ואף ניתוח המרכיבים של טיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מורכבת של מגוון רחב של סוגי תאים, טיים חיוני להתפתחות של סרטן. לבירור תנאי הגידול האופטימלית, תאים סרטניים מושכים ומונוציטים באמצעות הפרשת גורמים chemotactic. כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון של גיוס מונוציט מאת גידול תאים במבחנה. למטרה זו, נעשה שימוש בשילוב של ג’ין inducible ביטוי במער?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר ז’קלין רוזנברג להגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי לנו מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של/לאומי מכוני הבריאות בעזרת מענק לך DeClerck (להעניק 5R01 CA 129377) ושל קרן מרטל. טי-ג’יי. MH Kubala היא זוכת פרס מחקר לאגודה לפיתוח הקריירה של מכון המחקר סבן-החולים בלוס אנג’לס לילדים.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
