Долгосрочный живых изображений устройства для улучшения экспериментальных манипуляций личинок данио рерио
Summary
Эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который является разобщенным устройство, предназначенное для ориентации и сдерживать данио рерио личинки. Конструкция позволяет хвост перерезка и долгосрочной коллекции изображений с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии заживление и регенерацию.
Abstract
Данио рерио личинка — организм важной моделью для развития биологии и заживление ран. Кроме того данио рерио личинка является ценным системой для живой разрешением микроскопических изображений динамических биологических явлений в пространстве и времени с сотовой резолюции. Однако традиционный метод инкапсуляции агарозы для живых изображений могут препятствовать развития личинок и подроста тканей. Таким образом, эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который был разработан и изготовлены как функционально разобщенным устройство ориентации личинок для микроскопии высокого разрешения допуская хвостовой плавник перерезка в устройство и последующих безудержной хвост развития ре роста. Это устройство позволяет ранения и долгосрочное изображений при сохранении жизнеспособности. Учитывая, что форма zWEDGI 3D печати, настраиваемость его геометрии сделать его легко модифицирован для разнообразных данио рерио графических приложений. Кроме того zWEDGI предлагает многочисленные преимущества, такие как доступ к личинки во время экспериментов за ранение или для применения реагентов, параллельно ориентации несколько личинок для упорядоченной обработки изображений и повторного использования устройства.
Introduction
Регенеративной способностью личинок данио рерио данио рерио делают их организма идеальная модель для изучения ответ раны, а также исцеления и отрастания1,2,3,4. Доступ к массиву данио рерио трансгенных линий и данио рерио анатомические прозрачности дальше повышения их полезности в vivo исследований рану ответ события, а также долгосрочные восстановительные процессы4. Изучение этих биологических процессов, с помощью микроскопии высокого разрешения замедленной флуоресценции поэтому требует живой изображений данио рерио устройство, которое позволяет для высокой стабильности и минимальное движение личинок данио рерио при сохранении жизнеспособности. Это ключ, что устройство позволяет эффективного ранены во время заживления и регенерации происходит не зависит от устройства.
Стандартный живой изображений стабилизации метод встраивания личинка в агарозном во время живых изображений ограничивает рост и заживление регенерации5 и может увеличить уровень смертности, поскольку личинки начинают показывать знак сердца стресс и ткани некроза после четырех 4часов. Таким образом удаление агарозы из регионов интерес часто является необходимым для обеспечения нормального развития и регенерации6, подвергая личинки потенциальный ущерб как агарозы отрезать. Кроме того с агарозы, встраивание технику, пользователь должен ориентировать личинок в короткое время прежде чем агарозы затвердевает5,6,7. Быстро манипулирования личинка требует не только мастерство пользователя, также опасность повреждения личинок. Хотя были описаны методы стабилизации личинка для живых изображений обойти эти недостатки, такие как ребристых агар Уэллс3 или divets8, использование силиконовые вакуумные смазка для создания изображений камеры с трубопроводом ПВХ или других материалы6и вращения труб9, многие из этих методов являются труда интенсивный, грязный, часто не используемые повторно и не позволяют экологических манипуляций (наркотиков лечения, ранив и т.д.) после монтажа рыбы.
Таким образом zWEDGI устройство (рис. 1) была разработана для преодоления некоторых из недостатков, агар, крепление для долгосрочных живых изображений данио рерио личинок допуская манипуляции образца. ZWEDGI состоит из трех полуоткрытые разобщенным камер (рис. 1A), чтобы разрешить для загрузки, сдержанность, ранив и визуализация 2-4 дней после оплодотворения данио рерио личинок. Устройство изготовлено из полидиметилсилоксан (PDMS) и помещен на крышку выскальзования изображений блюдо дно стекла 60 мм. Дизайн, здесь представлены предназначен для заживления раны исследований, однако использование модульной конструкции и изготовление стандартных технологий сделать дизайн zWEDGI, изменяемые и поддаются различных экспериментальных процедур, особенно для процедур, требуется минимальная сдержанность с экспериментальной манипуляции и долгосрочное изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Устройство zWEDGI предназначен для захвата 3D Замедленная съемка изображений путем стабилизации и ориентации рыбы в пределах небольшой рабочее расстояние объектив высокого разрешения Микроскоп. Выполняя эти спецификации, это также улучшение над традиционными агар основе подготовки для…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать первичный проект из Morgridge института для финансирования исследований и лаборатории для оптических и вычислительной аппаратуры. Мы также признаем, что финансирование из низ # R01GM102924 (AH и Кве). KH, JMS, RS, Ай и Кве задуман и разработан исследования. KH и JMS исполнил все эксперименты с поддержкой из DL, КП и RS. KH, JS, RS, Ай и Кве способствовали написания манускрипта.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
