Zebrafish लार्वा के प्रयोगात्मक हेरफेर में सुधार के लिए दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग डिवाइस
Summary
यह पांडुलिपि zWEDGI (विकास और इमेजिंग के लिए zebrafish घायल और फंसाने वाली डिवाइस) का वर्णन करती है, जो zebrafish लार्वा को ओरिएंट और नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक compartmentalized डिवाइस है । डिजाइन पूंछ transection और घाव भरने और पुनर्जनन के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों के दीर्घकालिक संग्रह परमिट ।
Abstract
zebrafish लार्वा दोनों विकासात्मक जीवविज्ञान और घाव भरने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव है । इसके अलावा, zebrafish लार्वा सेलुलर संकल्प के साथ अंतरिक्ष और समय में गतिशील जैविक घटना के लाइव उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है । हालांकि, लाइव इमेजिंग के लिए agarose encapsulation के पारंपरिक विधि लार्वा विकास और ऊतक पुनर्विकास में बाधा कर सकते हैं । इसलिए, इस पांडुलिपि zWEDGI (zebrafish घायल और विकास और इमेजिंग के लिए डिवाइस फंसाने), जो डिजाइन और एक कार्यात्मक compartmentalized डिवाइस के रूप में गढ़े गए उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए ओरिएंट लार्वा की अनुमति का वर्णन caudal फिन डिवाइस और बाद में अनर्गल पूंछ विकास और फिर से विकास के भीतर transection । व्यवहार्यता बनाए रखते हुए यह डिवाइस घायल और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । यह देखते हुए कि zWEDGI मोल्ड 3d प्रिंटेड है, इसके geometries की कस्टमाइज़ेशन विविध zebrafish इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इसे आसानी से संशोधित कर देते हैं । इसके अलावा, zWEDGI कई लाभ प्रदान करता है, इस तरह के घावों के लिए प्रयोग के दौरान लार्वा के लिए उपयोग के रूप में या रिएजेंट के आवेदन के लिए, सुव्यवस्थित इमेजिंग के लिए एकाधिक लार्वा के समानांतर अभिविन्यास, और डिवाइस के पुनर्प्रयोज्य ।
Introduction
zebrafish लार्वा की अपक्षयी क्षमता ढाणियो rerio उन्हें घाव प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाने के साथ ही चिकित्सा और regrowth1,2,3,4. ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों और zebrafish के संरचनात्मक पारदर्शिता की एक सरणी के लिए उपयोग और आगे के रूप में अच्छी तरह से अब अवधि के अपक्षयी प्रक्रियाओं4के रूप में घाव प्रतिक्रिया घटनाओं के vivo अध्ययन में उनकी उपयोगिता को बढ़ाने । इन जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन उच्च संकल्प समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इसलिए एक लाइव इमेजिंग zebrafish डिवाइस है कि उच्च स्थिरता और zebrafish लार्वा की न्यूनतम आंदोलन के लिए अनुमति देता है, जबकि व्यवहार्यता बनाए रखने की मांग । यह महत्वपूर्ण है कि डिवाइस प्रभावी घाव भरने के लिए अनुमति देता है, जबकि चिकित्सा और पुनर्जनन डिवाइस से अप्रभावित होते हैं ।
लाइव इमेजिंग के दौरान agarose में लार्वा को एंबेड करने की मानक लाइव इमेजिंग स्थिरीकरण विधि वृद्धि और घाव पुनर्जनन5 को प्रतिबंधित करता है और मृत्यु दरों में वृद्धि कर सकता है क्योंकि लार्वा चार के बाद हृदय तनाव और ऊतक परिगलन का संकेत दिखाना शुरू कर देते हैं । घंटे4. इसलिए, ब्याज के क्षेत्रों से agarose को हटाने अक्सर सामांय विकास और पुनर्जनन6की अनुमति के लिए आवश्यक है, agarose दूर काट रहा है के रूप में संभावित नुकसान के लिए लार्वा को उजागर । इसके अलावा, agarose एंबेडिंग तकनीक के साथ, उपयोगकर्ता कम समय में लार्वा ओरिएंट चाहिए पहले agarose जम5,6,7। तेजी से लार्वा हेर-फेर न केवल उपयोगकर्ता के कौशल की आवश्यकता है, यह भी लार्वा को नुकसान जोखिम । हालांकि लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा को स्थिर करने के तरीके इन खामियों को दरकिनार करने के लिए वर्णित किया गया है, जैसे मेड़ आगर वेल्स3 या divets8, सिलिकॉन वैक्यूम तेल का उपयोग पीवीसी पाइपिंग या अन्य के साथ एक इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए सामग्री6, और रोटेशन9टयूबिंग, इन तरीकों में से कई श्रम गहन, गन्दा, अक्सर गैर पुन: प्रयोज्य और पर्यावरण हेरफेर (नशीली दवाओं के उपचार, घायल आदिके लिए अनुमति नहीं है) के बाद मछली बढ़ गया है ।
इसलिए, zWEDGI डिवाइस (चित्र 1) zebrafish लार्वा की लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते हुए आगर की कमियों में से कुछ को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि नमूना हेरफेर की अनुमति । zWEDGI तीन अर्द्ध खुले compartmentalized कक्षों के होते हैं (चित्र 1a) लदान के लिए अनुमति देने के लिए, संयम, घायल और इमेजिंग 2 से 4 दिनों के बाद निषेचन zebrafish लार्वा. डिवाइस Polydimethylsiloxane (PDMS) से गढ़े और एक ६० mm ग्लास नीचे इमेजिंग डिश के कवर पर्ची पर रखा है । डिजाइन यहां प्रस्तुत घाव भरने के अध्ययन के लिए करना था, लेकिन एक मॉड्यूलर डिजाइन और मानक निर्माण प्रौद्योगिकियों के उपयोग zWEDGI डिजाइन संशोधित करने और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए उत्तरदायी, विशेष रूप से प्रक्रियाओं के लिए है कि प्रयोगात्मक हेरफेर और दीर्घकालिक इमेजिंग के साथ ंयूनतम संयम की आवश्यकता होती है ।
Protocol
नोट: आधार zWEDGI डिजाइन zebrafish लार्वा कि 2 से 4 दिनों के बाद निषेचन (dpf) के लिए तैयार किया गया था और विस्कॉंसिन-मैडिसन अनुसंधान पशु संसाधन केंद्र के विश्वविद्यालय के दिशानिर्देशों का पालन करें ।
1. मो?…
Representative Results
Discussion
zWEDGI डिवाइस का उद्देश्य स्थिर और एक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप उद्देश्य के छोटे से काम दूरी के भीतर मछली ओरिएंट द्वारा 3 डी समय चूक इमेजिंग पर कब्जा करने के लिए है । इन डिजाइन विनिर्देशों की बैठक के दौरान, य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अनुसंधान के लिए Morgridge संस्थान और ऑप्टिकल और अभिकलनी इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए प्रयोगशाला से प्राथमिक परियोजना धन स्वीकार करना चाहते हैं । हम भी NIH # R01GM102924 (आह और KWE) से धन स्वीकार करते हैं । KH, JMS, रू, आह और KWE की कल्पना की और अध्ययन डिजाइन किया । KH और JMS ने डीएल, केपी और आरएसी से समर्थन के साथ सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया । KH, जे एस, आरएस, आह और KWE ने पांडुलिपि के लेखन में योगदान दिया ।
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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