उपास्थि और त्वचा के अनुरूप एक nanocellulose-alginate आधारित bioink का उपयोग कर मुद्रित किया गया । स्याही एक एकल कदम निष्क्रिय मिश्रण इकाई के माध्यम से मुद्रण से पहले सेलुलर थे । निर्माण के लिए समान रूप से सेलुलर हो प्रदर्शन किया गया, उच्च व्यवहार्यता है, और भेदभाव के अनुकूल मार्करों का प्रदर्शन ।
प्रिंटिंग ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए निर्माण के तेजी से और प्रतिलिपि निर्माण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । इस अध्ययन में, दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप bioink पूर्व cellularization एक उपंयास निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक का उपयोग करने के बाद गढ़े गए थे । इस तकनीक को एक उच्च चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन के मिश्रण में शामिल कदम को सरल बनाने के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था । आवश्यक के माध्यम से जमा रेशा का समाधान मुद्रण से पहले सेल वितरण में एकरूपता के आश्वासन को कोशिकाओं या बड़े सेल के झुरमुट कि सुई रोकना कर सकते है की अवधारण के बिना क्षेत्रों के जमाव से बचने के लिए । हम तेजी से दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के लिए एक bioink से पहले एक सेल निलंबन मिश्रण करने की क्षमता का प्रदर्शन । दोनों ऊतक अनुरूप अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए संस्कृति हो सकता है । ऊतकीय विश्लेषण दोनों सेल व्यवहार्यता और ऊतक विशिष्ट extracellular मैट्रिक्स (ECM) मार्करों जैसे glycosaminoglycans (परिहास) और कोलेजन मैं क्रमशः के रूप में प्रदर्शन किया ।
हाल के वर्षों में, तीन आयामी (3 डी) प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी और अधिक शोधकर्ताओं के लिए सुलभ हो गया है, की अनुमति तकनीक और अधिक व्यापक रूप से ऊतक सादृश्य के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है । प्रिंटिंग के लिए बहुमुखी ऊतक के निर्माण की तेजी से और दोहराया निर्माण की सुविधा के द्वारा जैव चिकित्सा अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव का वादा किया । इस तरह के प्रिंटिंग तकनीक की जड़ में तीन आयामों में (एक स्याही के रूप में जाना जाता है) के लिए ठीक से जमाव को नियंत्रित करने की क्षमता में देता है । यह मैट्रिक्स रचनाओं, सक्रिय कारकों के विभिंन क्षेत्रों के साथ जटिल पाड़ों की पीढ़ी की अनुमति देता है, और कोशिकाओं है कि और अधिक सही देशी ऊतक संरचना दोहराऊंगा कर सकते हैं ।
प्रिंटिंग उपास्थि1, त्वचा2, मांसपेशी3, और हड्डी4सहित कई ऊतक अनुप्रयोगों के लिए निर्माण के लिए उपयोग किया गया है । इन ऊतकों को अपने आंतरिक धारीदार सूक्ष्म आर्किटेक्चर है कि परत द्वारा recapitulation के लिए उपयुक्त है द्वारा परत के कारण प्रिंटिंग के लिए आकर्षक हैं । विशेष रूप से, त्वचा के पास एक अच्छी तरह से परिभाषित multilayered संरचना5, जो परत के माध्यम से निर्माण के लिए उपयुक्त है, द्वारा परत इस तरह के रूप में प्रिंटिंग तकनीक । इसके अतिरिक्त, प्रिंटिंग के लिए उत्पादन है कि आवश्यक संरचनात्मक आयामों और आकार के अधिकारी के लिए ऊतक दोष की मरंमत का उपयोग किया जा सकता है । रोगी-विशिष्ट आकार और आकार6 के साथ सामग्री उत्पन्न करने की क्षमता सहित कई ऊतकों की आंशिक मरम्मत की मांग को संबोधित करने के लिए शुरू कर सकते हैं लेकिन अस्थि दोषों को सीमित नहीं, उपास्थि क्षति, और त्वचा के घावों जिनकी हद से भिन्न होता है मरीज को रोगी ।
इस अध्ययन में, दो ऊतक के अनुरूप (जोड़दार उपास्थि और त्वचा) पूर्व के प्रिंटिंग-सेल् फी इंक के माध्यम से गढ़े गए थे । सेल के निलंबन के साथ एक bioink के पर्याप्त सम्मिश्रण सुनिश्चित करना है कि कोशिका व्यवहार्यता के संरक्षण जबकि वर्दी सेल वितरण सुनिश्चित कर सकते हैं एक चुनौती हो सकती है । बाहर निकालना के माध्यम से प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त स्याही अक्सर अत्यधिक चिपचिपा रहे है और इसलिए एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए व्यापक मिश्रण की आवश्यकता है । कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति कठोर मिश्रण शर्तों के तहत हो सकता है और नकारात्मक व्यवहार्यता को प्रभावित । अध्ययनों से पता चला है कि inkjet मुद्रण प्रक्रिया के दौरान सबसे सेल मौत7,8मिश्रण के रूप में तैयारी के दौरान होता है । जबकि पारंपरिक आंदोलन के साथ9 मिश्रण inkjet मुद्रण10के लिए उपयुक्त कम चिपचिपापन स्याही के लिए पर्याप्त हो सकता है, एक उच्च चिपचिपापन bioink में कोशिकाओं के मिश्रण अधिक बाहर निकालना के लिए उपयुक्त है प्रिंटिंग अधिक कठिन है । इस जरूरत को संबोधित करते हुए, मिश्रण नलिका का उपयोग प्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान11के दौरान स्याही के सम्मिश्रण के लिए और अधिक लोकप्रिय हो गया है । इन मिक्सर भी व्यापक रूप से microfluidics अनुसंधान में उपयोग किया गया है, जहां कम रेनॉल्ड्स संख्या के साथ तरल पदार्थ के मिश्रण महत्वपूर्ण है12. एक सतत मिश्रण प्रक्रिया के उपयोग के लिए एक bioink में एक सेल निलंबन मिश्रण मुद्रण प्रक्रिया के दौरान एकरूपता के लिए अनुमति होगी । हालांकि, के बाद से सेल सस्पेंशन एक bioink की तुलना में कम चिपचिपापन अधिकारी, कठिनाइयों मुद्रण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के अवसाद को रोकने में पैदा होगा9,13,14। वैकल्पिक रूप से, मुद्रण करने से पहले एक bioink में कक्षों के मिश्रण इस समस्या को हल कर सकते हैं ।
एक bioink में सम्मिश्रण के दौरान कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए, हम कदम की न्यूनतम संख्या में एक bioink में कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई पर आधारित एक तकनीक विकसित की है. मिश्रण इकाई के माध्यम से सामग्री के प्रवाह के माध्यम से उत्पन्न अराजक मिश्रण reproducibly करने के लिए पर्याप्त है एक साथ दो घटक मिश्रण15,16. यह विधि मुख्य रूप से किसी भी bioink कि बाहर निकालना के लिए उपयुक्त के साथ किसी भी सेल निलंबन के सम्मिश्रण को सरल बनाने के लिए विकसित किया गया था । मिश्रण प्रक्रिया में कदम की संख्या मिश्रण में उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता भिन्नता को खत्म करने के लिए कम किया गया था. अत्यधिक मिश्रण कदम समय लगता है और सभी स्याही के लिए लागू नहीं हो सकता है, विशेष रूप से जब कोशिकाओं को शामिल कर रहे हैं । माध्यमिक, हम एक मिश्रण प्रक्रिया है कि स्वयं दोनों को समाहित किया गया था विकसित करने के उद्देश्य से बाँझ की रक्षा और नमूना हानि को कम ।
इस पांडुलिपि में, हम एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक है कि हैंडलिंग और उच्च कोशिका व्यवहार्यता और वर्दी वितरण में परिणाम को कम करता है का उपयोग कर एक bioink के साथ एक सेल निलंबन के सम्मिश्रण का प्रदर्शन । इन पूर्व सेलुलर स्याही तो या तो एक उपास्थि या त्वचा एक या दो प्रकार के सेल के साथ निर्माण, क्रमशः है कि 6 सप्ताह तक के लिए संस्कृति रहे है प्रिंट का उपयोग कर रहे हैं । bioink का उपयोग एक alginate-nanocellulose मिश्रण है, जो पहले1प्रिंट करने के लिए उपयुक्तता दिखाया गया है ।
के रूप में इस पांडुलिपि में प्रदर्शन किया, पूर्व-सेलुलर स्याही के लिए या तो उपास्थि या त्वचा के अनुरूप है कि अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए संस्कृति थे गढ़े का प्रिंट थे । निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक का उपयोग कर सम्मिश्रण के बाद सेल व्यवहार्यता पारंपरिक मिश्रण तरीकों की तुलना में अधिक था. इसके अतिरिक्त, मिश्रण इकाई का उपयोग कर मिश्रण की प्रक्रिया का सरलीकरण कदम हैंडलिंग की संख्या को कम करता है और मिश्रण की हद में बेहतर स्थिरता के लिए अनुमति देता है । अंततः, bioink के भीतर दोनों सेल वितरण में बेहतर reproducibility में यह परिणाम है, और निर्माण और प्रयोगात्मक समूहों के पार । ऐसे परिहास और कोलेजन के रूप में ऊतक विशिष्ट ECM घटकों के जमाव मैं दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के लिए मनाया गया था, क्रमशः संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद । यह दोनों मिश्रण तकनीक और चुना संरचना के लचीलेपन के लिए अलग ऊतक लक्ष्य बनाना इंगित करता है । दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप का निर्माण एक nanocellulose-alginate bioink और विशिष्ट इंजीनियर ऊतक लक्ष्य के लिए के लिए प्रिंटिंग तकनीक के दोनों का उपयोग के लचीलेपन का प्रदर्शन किया । हम नीचे अध्ययन के दो घटकों पर चर्चा करेंगे: (1) निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक, और (2) उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार ।
विकास और एक bioink में एक सेल निलंबन के सम्मिश्रण के लिए एक तकनीक का अनुकूलन इन constructs के निर्माण के लिए सर्वोपरि था । पारंपरिक कम चिपचिपापन hydrogel सामग्री के विपरीत, स्याही के उच्च चिपचिपापन एक bioink के पूर्व cellularization में कठिनाई के परिणामस्वरूप मुद्रण से पहले । एक bioink, एक चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन के मिश्रण कदम के लिए एक प्रोटोकॉल में सेल निगमन के पारंपरिक विधि के लिए एक विकल्प के रूप में विकसित किया गया था और चर्चा की । इसके अतिरिक्त, ऊतक के निर्माण में इस मिश्रण तकनीक के व्यावहारिक अनुप्रयोग का मूल्यांकन किया गया था । यह एक कदम मिश्रण दृष्टिकोण पारंपरिक मिश्रण तकनीक पर कई फायदे हैं, मिश्रण अनुपात नियंत्रित शामिल, उच्च और अनियमित कतरनी तनाव के ंयूनतम, और एक बंद प्रणाली मिश्रण वाहिकाओं में नमूना बंद को खत्म करने के लिए । हालांकि, इस तकनीक में कई महत्वपूर्ण कदम है सेल के लिए पारंपरिक तरीकों पर अपने फायदे सुनिश्चित करने के लिए/bioink सम्मिश्रण । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सेल सिरिंज में कोशिकाओं को निलंबित कर दिया और अच्छी तरह से सम्मिश्रण से पहले मिलाया जाता है. उठाने और सिरिंज में कोशिकाओं के हस्तांतरण और मिश्रण की प्रक्रिया शुरू करने के बीच एक समय अंतराल के बहुत बड़े तलछट, जो असमान मिश्रण और वितरण में एक मुद्रित रेशा में परिणाम होगा कोशिकाओं के कारण कर सकते हैं । अवसादन मनाया जाता है, तो तुरंत मिश्रण करने से पहले निष्क्रिय मिश्रण इकाई विधानसभा के सरल उलटा (2-3 बार) कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए पर्याप्त है और एक समान वितरण सुनिश्चित करने से पहले सम्मिश्रण । यह भी महत्वपूर्ण है कि सिरिंजों में हवा के बुलबुले को खत्म कर दिया जाता है या यह सुनिश्चित करने से पहले कम किया जाता है कि मिश्रण अनुपात निरंतर बना रहे. यदि बड़े हवाई बुलबुले bioink कारतूस में रहने से पहले सम्मिश्रण, यह अनुशंसा की जाती है कि समाधान मिश्रण इकाई के माध्यम से चलाने के लिए एक अतिरिक्त समय पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए । यदि हवा के बुलबुले बने रहते हैं, मुद्रण कारतूस के कोमल दोहन/ इसके अतिरिक्त, यदि एकाधिक सामग्री सम्मिश्रण (कई मिश्रण इकाइयों या सामग्री) अधिक जटिल निर्माण के लिए आवश्यक है, मिश्रित किया जा करने के लिए एक स्याही/सेल सस्पेंशन की सांद्रता के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए कि सम्मिश्रण के माध्यम से कमजोर के बाद, उचित अंतिम एकाग्रता अभी भी हासिल की है ।
अंय सम्मिश्रण तकनीक की तुलना में, निष्क्रिय मिश्रण इकाई cellularize स्याही के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण है । दोहरे सिरिंज मिश्रण, या एक रंग या अन्य उपकरण के साथ उभार के रूप में अन्य मिश्रण तकनीक के विपरीत, निष्क्रिय मिश्रण इकाई बैचों और उपयोगकर्ताओं के बीच सम्मिश्रण में अधिक निरंतरता की अनुमति देता है. इस तरह के एक रंग मिश्रण के रूप में मैनुअल मिश्रण तकनीक की प्रकृति, मिश्रण की हद और दर में अधिक से अधिक उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता भिन्नता में परिणाम. इसके अतिरिक्त, इस तरह के निष्क्रिय मिश्रण इकाई और दोहरी सिरिंज मिश्रण के रूप में बंद सिस्टम एक पेट्री डिश या ट्यूब के भीतर मैनुअल मिश्रण की तुलना में कोई नमूना नुकसान के लिए कम है ।
दोनों ऊतक अनुरूप इस पांडुलिपि में गढ़े bioink और या तो एक या दो प्रकार के सेल के एक एकल प्रकार के शामिल थे । हालांकि, ऊतक अनुरूप है कि वास्तुकला है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के साथ विशिष्ट स्याही के क्षेत्रों में शामिल है का मुद्रण अधिक शारीरिक ऊतक के निर्माण के लिए आवश्यक हो सकता है20,21, 22. अद्वितीय रचनाओं या कार्यक्षमताओं के साथ और अधिक विशेष स्याही मौजूदा स्याही के कई प्रकार के सम्मिश्रण के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है multimaterial स्याही है कि अलग रचनाओं या कार्यक्षमताओं23बनाने के लिए, 24. इस तरह के चमड़े के नीचे परत करने के लिए त्वचा के रूप में ऊतक संक्रमण क्षेत्रों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है या एक ऊतक के अस्थि क्षेत्र को उपास्थि जहां bioink रचना25,26 का एक ढाल के विकास को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है इन महत्वपूर्ण क्षेत्रों में पाया मूल निवासी27ऊतकों । इसके अतिरिक्त, एक मिश्रण इकाई का उपयोग किया जा सकता है विकास कारकों में मिश्रण करने के लिए और morphogens से पहले के लिए बंद मिश्रण प्रणाली के साथ नमूना नुकसान के उंमूलन महंगा और कम एकाग्रता के उपयोग के लिए आकर्षक है, जहां नमूना नुकसान के भीतर अपने अंतिम एकाग्रता के लिए एक परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं, विशेष रूप से मुद्रित निर्माण, खासकर जब ग्रैडिएंट शामिल हैं ।
इस अध्ययन में उपयोग किया निष्क्रिय मिश्रण इकाई सहित किसी भी मिश्रण तकनीक, के साथ एक सीमा, यांत्रिक संवेदनशील कोशिका प्रकार के नुकसान का खतरा है. उदाहरण के लिए, अलग स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा या भ्रूण, या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उन यांत्रिक क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते है28,29। मिश्रण प्रक्रिया में शामिल कतरनी बलों के कारण कोशिकाओं पर असामान्य यांत्रिक तनाव प्रदान करना, और वे व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए संतुलित किया जाना चाहिए30. जबकि इस अध्ययन में प्राथमिक fibroblasts और chondrocytes के उपयोग के परिणामस्वरूप अच्छी व्यवहार्यता (चित्रा 2), अधिक अध्ययन के लिए सुरक्षित मिश्रण दरों और अधिक संवेदनशील सेल प्रकार के लिए अनुपात निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं । तब तक, यह सिफारिश की है कि मिश्रण व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए एक स्थिर धीमी दर के तहत प्रदर्शन किया जा । इसके अतिरिक्त, इस अध्ययन में चुना गया कोशिका घनत्व पिछले अध्ययनों के आधार पर निर्धारित किया गया था1. इस कोशिका घनत्व सभी प्रकार के सेल के लिए आदर्श नहीं हो सकता है ।विशेष रूप से, एक उच्च एकाग्रता पर कोशिकाओं के मिश्रण कोशिका व्यवहार्यता और ऊतक गठन31,३२में सुधार हो सकता है कि सेल सेल संपर्कों में वृद्धि हो सकती है । इसी तरह की नस में, निष्क्रिय मिश्रण इकाई में सेल spheroids या अंय सेल समुच्चय३३ को एक स्याही में सम्मिश्रण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
के रूप में प्रस्तावित और इस अध्ययन में प्रदर्शन किया, एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रणाली तेजी से एक चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन मिश्रण कर सकते हैं । हालांकि कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति के लिए जोखिम अभी भी बनी हुई है, दृष्टिकोण एक अध्ययन के भीतर और उपयोगकर्ताओं में सम्मिश्रण में अधिक निरंतरता की अनुमति देता है । पूर्व सेलुलर इस दृष्टिकोण का उपयोग स्याही के लिए दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप है कि अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए किया गया था गढ़े थे, और ऊतक विशिष्ट ECM मार्करों के जमाव का प्रदर्शन । भविष्य के अध्ययन निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रणाली के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और अधिक जटिल ऊतक सादृश्य के निर्माण के लिए मानकीकृत स्याही से विशेष स्याही मिश्रण होगा ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |