In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Yo Ching Cheng; Samia Hannaoui; Theodore Ralph John; Sandor Dudas; Stefanie Czub; Sabine Gilch

doi:10.3791/56373

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Articolo metodologico

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

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DOI:

10.3791/56373

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29 settembre 2017

Yo Ching Cheng^*¹ , Samia Hannaoui^*¹ , Theodore Ralph John² , Sandor Dudas³ , Stefanie Czub³ , Sabine Gilch¹

¹Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, ²Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, ³Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

Abstract

La tecnica RT-QuIC è un sensibili in vitro senza cellula del prion amplificazione saggio basato principalmente sul seminato misfolding e aggregazione del substrato di proteina (PrP) prionica ricombinante usando i semi del prion come modello per la conversione. RT-QuIC è una tecnica novella di alto-rendimento che è analoga alla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR). Rilevamento della crescita della fibrilla dell'amiloide è basato sul colorante Tioflavina T, che reagisce in su specifica interazione con proteine ricche ᵦ-foglio. Pertanto, la formazione dell'amiloide possa essere rilevati in tempo reale. Abbiamo tentato di sviluppare un test di screening non invasivo affidabile per rilevare i sprecare prioni (CWD) la malattia cronica in estratto fecale. Qui, in particolare abbiamo adattato la tecnica RT-QuIC per rivelare PrP^Sc semina attività nelle feci di CWD infettati cervidi. Inizialmente, l'attività di semina degli estratti fecali che abbiamo preparato era relativamente basso in RT-QuIC, probabilmente a causa di potenziali inibitori di dosaggio del materiale fecale. Per migliorare l'attività semina degli estratti di feci e rimuovere potenziali inibitori di dosaggio, abbiamo omogeneizzato i campioni fecali in un tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Abbiamo anche presentato i campioni di diverse metodologie per concentrarsi PrP^Sc sulla base di precipitazione della proteina usando acido fosfotungstico sodio e forza centrifuga. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC che comprendeva la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione. Così, abbiamo stabilito un protocollo per rilevazione sensibile del prione CWD semina attività nelle feci di cervidi pre-clinici e clinici di RT-QuIC, che può essere uno strumento pratico per la diagnosi non invasiva di CWD.

Introduzione

Malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini neurodegenerative compreso la malattia di Creutzfeldt – Jakob (CJD) negli esseri umani, l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, scrapie nelle pecore e capre e di sprecare cronica malattia (CWD) nei cervidi ¹^,². Le TSE sono caratterizzate da aspetto spongiforme distintivo e perdita di neuroni nel cervello. Secondo l'ipotesi della "proteina solo", i prioni sono costituiti principalmente di PrP^Sc ('Sc' scrapie) ³, un'isoforma misfolded della proteina prionica cellulare host-codificati,....