Segunda generación armónica las señales en esclera de conejo como una herramienta para la evaluación del tejido terapéutico Cross-linking (TXL) para la miopía

Summary

Este protocolo describe técnicas para la evaluación química del cross-linking de la esclera de conejo usando proyección de imagen de segunda harmónica y calorimetría diferencial.

Abstract

Métodos para fortalecer el tejido mediante la introducción de enlaces químicos (cross-linking no enzimática) en proteínas estructurales (colágenos fibrilares) para la terapia incluyen tejido Cross-linking métodos (TXL) y fotoquímica del cross-linking. Tales métodos para inducir cambios de propiedad mecánica del tejido se están empleando a la córnea en enfermedades adelgazamiento corneal (mecánicamente debilitado) queratocono así como la esclerótica en la miopía progresiva, donde el adelgazamiento y debilitamiento de la parte posterior esclera ocurre y probablemente contribuye a la elongación axial. Las proteínas de la blanco principal para tal fortalecimiento de tejido son colágenos fibrilares que constituyen la gran mayoría de proteínas de peso seco de la córnea y la esclerótica. Fortuitamente, colágenos fibrilares son la fuente principal de segunda generación armónica señales en el espacio extracelular del tejido. Por lo tanto, modificaciones de las proteínas de colágeno, como las inducida a través de cross-linking terapias, potencialmente podrían ser detectados y cuantificados mediante el uso de la microscopia de segunda generación armónica (SHGM). Monitoreo SHGM señales mediante el uso de un láser escáner sistema de microscopía juntada con una excitación infrarrojo luz de fuente es un método de proyección de imagen moderna emocionante que goza de uso extenso en las ciencias biomédicas. Así, el actual estudio fue emprendido para evaluar el uso de la microscopia SHGM como un medio para medir efectos Cross-linking en vivo ex esclerótica de conejo, después de una inyección de un producto químico agente del cross-linking en el espacio de la sub-Tenon (sT), causados por un inyección de acercarse es práctica estándar para causar anestesia ocular durante procedimientos clínicos oftalmológicos. El químico agente del cross-linking, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), es de una clase de conservantes cosméticos conocida como formaldehído liberando agentes (FARs). Cambios esclerales tras reacción con SMG resultaron en un aumento en las señales de la SHG y correlacionados con cambios en la temperatura de desnaturalización térmica, un método estándar para evaluar inducida tejido efectos del cross-linking.

Introduction

Miopía progresiva se postula para ser tratable a través de no-enzimáticos escleral del cross-linking (fotoquímico o química), que tiene sentido dado que el bloqueo de reticulación enzimática de colágeno puede aumentar la privación de forma experimental (FD)-inducida miopía de¹. Venimos y Phillips² recientemente discutida la viabilidad y el potencial de utilizar estándar irradiación ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica del cross-linking (también conocido como el protocolo de Dresden), abreviado aquí como (riboflavina CXL) para la estabilización escleral posterior detener la elongación axial en miopía. Este método fotoquímico se ha utilizado con éxito para tratar la desestabilización de la superficie anterior del globo (es decir, la córnea abultada) vista en keratectasia queratocono y post-LASIK. Sin embargo, aplicación de este protocolo CXL de la esclera es obstaculizado por problemas relacionados con dificultades en el acceso a la esclera posterior con una fuente de luz ultravioleta (UV), así como la necesidad de modificar un mucho mayor superficie área de tejido. Que dicho, el enfoque CXL se ha utilizado para detener la elongación axial en forma visualmente priva conejos (tarsorrhaphy), aunque las regiones múltiples de la esclera posterior requieren varias zonas separadas de la irradiación en eso estudio³. Por el contrario, la inyección de un agente químico estabilizador (es decir, agente Cross-linking) vía el espacio sT podría representar una manera más simple de modificar la esclera posterior, evitando la necesidad de introducir una fuente de luz UV. Esta técnica de inyección es conocida como una forma útil de inducir anestesia ocular durante procedimientos oftalmológicos como cirugía de catarata^4,5,6. WOLLENSAK⁷ ha descrito anteriormente el uso de una inyección de sT con gliceraldehído (un cross-linking agente químico similar en concepto al formaldehído liberando agentes (FARs) descritos en este estudio) rigidizar el conejo sclera y genipin ha ha demostrado que limitar la longitud axial en FD conejillos de Indias^8,9. Estos investigadores han demostrado una clara ventaja de la utilización de un agente químico soluble sobre la fotoquímica técnica CXL. Por lo tanto, escleral del cross-linking utilizando un agente químico inyectable de algún tipo, incluyendo el FARs (es decir, TXL)¹⁰, podría proporcionar un método de tratamiento viable para detener la progresión de la elongación escleral en miopía.

En los protocolos aquí presentados, se usa una solución química de cross-linking de sodio hydroxymethylglycinate (SMG), entregada vía la inyección de sT a la esclera de los ojos de conejo cadavérico. Hemos implementado protocolos similares para reticulación química tópica de la córnea. En particular en los estudios previamente divulgados, Cross-linking efectos dependientes de la concentración podría obtenerse utilizando SMG, con un rango de efecto que abarca bien superior a la alcanzable con CXL fotoquímica según lo determinado por análisis de desnaturalización térmica¹¹ .

Aquí se describen los protocolos para evaluar el efecto Cross-linking de SMG suministra a través de inyecciones de sT al tejido escleral, desnaturalización térmica utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) y microscopía de segunda de generación armónica (SHGM).

Mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC), también conocido como análisis térmico, una transición de desnaturalización térmica se mide, que para el tejido escleral es predominantemente guiado por las propiedades de los colágenos fibrilares, ya que constituyen la mayoría a granel de la proteína. Este método evalúa la estabilidad de la estructura molecular del colágeno y los bonos reticulados que estabilizan las fibrillas de colágeno, la estructura principal proteína terciario. Durante el calentamiento en el DSC, se alcanza una temperatura crítica de transición que da lugar a la desnaturalización de la molécula de colágeno, dando como resultado el desenrollar de la triple hélice, un proceso que constituye lo que comúnmente se conoce como gelatina. Esta desnaturalización térmica interrumpe enlaces del hidrógeno a lo largo de la molécula de colágeno y puede ser cambiado de puesto a temperaturas más altas a través de métodos reticulación inducida^12,13. Este método se ha utilizado durante muchas décadas, particularmente en la industria de biomateriales y de procesos que incluyen la fabricación de cuero. Sin embargo, este método requiere la extracción del tejido de la esclerótica y por lo tanto sólo puede ser útil como una técnica ex vivo .

Microscopia de la generación de segundo armónico (SHGM) se basa en las propiedades ópticas no lineales de materiales particulares, con entornos moleculares no centrosimétricas. En tales materiales, luz intensa, por ejemplo luz producida por el láser, genera señales de SHG, en el que la luz del incidente se dobla en frecuencia. Materiales biológicos que se conocen para crear señales SHG son colágeno, microtúbulos y miosina del músculo. Por ejemplo, colágeno excitada con una luz infrarroja de longitud de onda de 860 nm emite una señal de la SHG en la gama visible con longitud de onda de 430 nm. Segunda generación armónico (SHG) proyección de imagen de señales es un método prometedor para la evaluación de cross-linking del colágeno terapéutica. Ha sido conocido por más de 30 años que las fibrillas del colágeno en los tejidos emiten señales SHG¹⁴. Sin embargo, sólo recientemente imágenes de alta resolución se obtendría¹⁵ en una variedad de tejidos, incluyendo el tendón¹⁶, piel, cartílago¹⁷,¹⁸de los vasos sanguíneos y en los geles de colágeno¹⁹.

Basándose en este conocimiento, este estudio evalúa los cambios de señal SHG inducidos en la esclera a través de SMG químicamente inducida por Cross-linking del colágeno. Los resultados indican que la modificación de SMG de la esclera aumenta las señales SHG producidas a partir de haces de fibras de tejido colágeno (el más alto orden estructura cuaternaria formada por fibrillas de colágeno) y también produce un cambio morfológico estructural en el colágeno red de fibra, refleja en fibra paquete el “enderezando.”

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron con ojos de conejo cadavérico en cabezas de conejo exogámica intacto. Se siguieron las guías todo institucional y nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. preparación de soluciones Preparación de SMG para TXL: Preparar 1 mL de concentración de 0,2 M de bicarbonato de sodio (NaHCO3) solución usando 0,0165 g de NaHCO3 en polvo disuelto en 1 mL de agua destilada. 0,1016 mg de sodio en polvo …

Representative Results

Temperatura de desnaturalización térmica (Tm) como un método de ensayo para evaluar el efecto del cross-linking TXL: En estos experimentos se utilizaron un total de 16 pares de ojos de conejo para el procedimiento TXL. Como parte inicial de este estudio, se evaluó la localización del cross-linking efecto inducido por una sola inyección de agente reticulante SMG por sT espacio en la cabeza del conejo cadavérico. Este tipo de experimento tiene relevancia para el trat…

Discussion

Experimentos realizados han mostrado evidencia apoya el uso de la microscopia de señal SHG como método para la evaluación de efectos en esclera, levantando la posibilidad futura de usar esta técnica como una herramienta de monitoreo para tratamientos del cross-linking del cross-linking de colágeno apuntan las proteínas de colágeno. De nota, un instrumento ya está en uso clínico que potencialmente puede captar esta señal SHG. Aunque este instrumento fue diseñado principalmente para la proyección de imagen derm…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8