Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Bewertung der chemische Vernetzung von den Kaninchen Sklera mit Erzeugung der zweiten harmonischen Bildgebung und differential scanning Kalorimetrie.
Abstract
Methoden, um Gewebe zu stärken, durch Einbringen von chemischen Bindungen (nicht-enzymatische Vernetzung) in Strukturproteinen (fibrillären kollagene) für die Therapie sind photochemische Vernetzung und Gewebe Vernetzung (TXL) Methoden. Solche Methoden zur Induktion mechanische Gewebe Eigenschaftsänderungen werden an der Hornhaut Hornhaut dünner (mechanisch geschwächt) Erkrankungen wie Keratokonus sowie der Sklera in progressive Myopie, wo Ausdünnung und Schwächung der hinteren eingesetzt Sklera auftritt und wahrscheinlich trägt zur axialen Dehnung. Die primäre Zielproteine für solche Gewebe stärken sind fibrillären Kollagene, die die große Mehrheit der Trockengewicht Proteine in der Hornhaut und Sklera darstellen. Fibrillären kollagene sind zufällig, die Hauptquelle der zweiten harmonischen Generation Signale in den Extrazellulärraum Gewebe. Daher könnten Veränderungen der Kollagen Proteine, wie Sie induziert durch Vernetzung Therapien, potenziell erkannt und quantitated durch den Einsatz von zweiten harmonischen Generation Mikroskopie (SHGM). Überwachung SHGM-Signale durch den Einsatz eines Laser-scanning-Mikroskopie-System gekoppelt mit einer Infrarot-Anregungslicht Quelle ist eine aufregende moderne bildgebende Verfahren, das weit verbreitete Verwendung in den biomedizinischen Wissenschaften zu genießen ist. So, die vorliegende Studie wurde unternommen, um die Verwendung von SHGM Mikroskopie zu bewerten, als ein Mittel zum Messen induzierte Vernetzung Effekte in ex Vivo Kaninchen Sklera, nach einer Injektion von einer chemischen Vernetzung Agent in der Sub-Zapfen Raum (sT), eine Injektion nähern das ist gängige Praxis für das verursachen der okulären Anästhesie während ophthalmologische klinische Verfahren. Die chemische Vernetzung Agent, ist Natrium Hydroxymethylglycinate (SMG), von einer Klasse der kosmetische Konservierungsstoffe wie Formaldehyd, die Freigabe von Agenten (FARs) bekannt. Skleralen Änderungen nach Reaktion mit SMG führten zu Erhöhungen der SHG Signale und korreliert mit Temperaturwechseln thermische Denaturierung, induziert eine Standardmethode zur Bewertung der Gewebe Vernetzung Effekte.
Introduction
Progressive Myopie wird durch nicht-enzymatische skleralen Vernetzung (photochemische und/oder chemischen), behandelbar sein postuliert, was Sinn macht, da die Sperrung Kollagen enzymatischer Vernetzung experimenteller Form Entbehrung (FD) erhöhen kann-induzierte Myopie-1. Dank und Phillips2 kürzlich diskutiert, die Machbarkeit und das Potenzial der Verwendung von standard UV-A Strahlung (UVA)-Riboflavin vermittelte photochemische Vernetzung (auch bekannt als Dresden-Protokoll), abgekürzt als (Riboflavin CXL) zur hinteren skleralen Stabilisierung um axialen Dehnung in Myopie Einhalt zu Gebieten. Diese photochemischen Methode wird erfolgreich eingesetzt zur Behandlung von Destabilisierung der vorderen Kugel Oberfläche (d.h. die gewölbte Hornhaut) in Keratokonus und Post-LASIK Keratektasie gesehen. Anwendung dieses CXL-Protokolls für die Lederhaut wird jedoch durch Probleme im Zusammenhang mit Schwierigkeiten beim Zugang zu den hinteren Sklera mit einer ultravioletten (UV) Lichtquelle sowie eine viel größere Gewebe Fläche bearbeiten zu müssen behindert. Dass gesagt wird, die CXL-Ansatz verwendet wurde, um axialen Dehnung in visuell Form Einhalt zu Gebieten beraubt Kaninchen (durch Tarsorrhaphy), obwohl mehrere Regionen der posterioren Sklera mehrere separate Bestrahlung Zonen in dieser Studie3erforderlich. Im Gegensatz dazu könnte Injektion eine chemische Stabilisierungsmittel (d.h. Vernetzungsmittel) über den sT-Space eine einfachere Möglichkeit, die hinteren Sklera, Vermeidung der Notwendigkeit der Einführung einer UV-Lichtquelle ändern darstellen. Dieser Injektionstechnik ist bekannt als ein nützliches Instrument zur Induktion okuläre Anästhesie bei ophthalmologischen Eingriffen wie z. B. Katarakt Chirurgie4,5,6. Wollensak7 hat die Verwendung einer sT-Injektion mit Glyceraldehyde (eine chemische Vernetzungsmittel ähnlich im Konzept der Freigabe Agenten (FARs) in dieser Studie beschriebenen Formaldehyd) beschriebenen Kaninchen Sklera und wieder versteift hat gezeigt worden, um axiale Länge in FD Meerschweinchen8,9zu beschränken. Die Ermittler haben einen klaren Vorteil der Verwendung eines löslichen chemischen Arbeitsstoff über die photochemische CXL Technik gezeigt. So skleralen Vernetzung mit injizierbaren chemische Vermittler eines Typs, einschließlich der FARs (d.h., TXL)10, könnten eine machbare Behandlungsmethode, das Fortschreiten der skleralen Dehnung in Myopie gesehen zu stoppen.
In der hier vorgestellten Protokolle verwenden wir eine chemische Vernetzung Lösung von Natrium Hydroxymethylglycinate (SMG), über sT-Injektion an der Sklera cadaveric Kaninchen Augen geliefert. Wir haben ähnliche Protokolle bisher für aktuelle chemische Vernetzung in der Hornhaut implementiert. Insbesondere in diesen bereits berichteten Studien konnte Konzentration abhängige Effekte Vernetzung mit SMG, mit einem Effekt-Angebot umfasst weit über demjenigen erreichbar mit photochemischen CXL durch thermische Denaturierung Analyse11 gewonnen werden .
Hier beschreiben wir Protokolle, um die vernetzende Wirkung der SMG über sT Injektionen skleralen Gewebe, thermische Denaturierung mit Differential Scanning Kalorimetrie (DSC) und Second Harmonic Generation Mikroskopie (SHGM) geliefert.
Mit differential scanning Kalorimetrie (DSC), auch bekannt als thermische Analyse ist ein thermische Denaturierung Übergang gemessen die für skleralen Gewebe ist überwiegend durch die Eigenschaften der fibrillären kollagene geleitet, da sie die größte Mehrheit bilden, des Proteins. Diese Methode wertet die Stabilität von Kollagen molekulare Struktur und die vernetzte Bande, die die Kollagen-Fibrillen, die wichtigsten tertiären Proteinstruktur stabilisieren. Beim Heizen in der DSC erreicht eine kritische Übergangstemperatur Denaturierung des Moleküls Kollagen ergibt, wodurch Abrollen der triple Helix, ein Prozess, der bildet, was man gemeinhin als Gelatine bekannt. Diese thermische Denaturierung stört Wasserstoffbrückenbindungen entlang der Kollagen-Molekül und kann zu höheren Temperaturen durch induzierte Vernetzung Methoden12,13verschoben werden. Diese Methode wurde verwendet, seit vielen Jahrzehnten, besonders im Bereich Biomaterialien und für Prozesse, die Leder-Herstellung enthalten. Allerdings ist diese Methode erfordert Extraktion der Sklera Gewebe und kann daher nur als ein ex-Vivo -Verfahren nützlich sein.
Erzeugung der zweiten harmonischen Mikroskopie (SHGM) basiert auf der nichtlinearen optischen Eigenschaften von bestimmten Materialien mit nicht Centrosymmetric molekulare Umgebungen. In solchen Materialien, intensives Licht, zum Beispiel Licht durch Laser erzeugt, erzeugt SHG Signale, in denen das einfallende Licht in Frequenz verdoppelt wird. Biologische Materialien, die bekannt sind, SHG Signale zu erstellen sind Kollagen, Mikrotubuli und Muscle Myosin. Zum Beispiel wird Kollagen begeistert mit einem Infrarot-Licht von 860 nm Wellenlänge ein SHG-Signal im sichtbaren Bereich mit 430 nm Wellenlänge emittieren. Zweite harmonische Erzeugung (SHG) Signal Bildgebung ist eine vielversprechende Methode zur Bewertung der therapeutischen Kollagen Vernetzung. Es ist seit mehr als 30 Jahren bekannt, dass Kollagen-Fibrillen in Geweben SHG Signale14abgeben. Allerdings konnte erst vor kurzem Bilder mit hoher Auflösung15 in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Sehne16, Haut, Knorpel17, Blutgefäße18, und Kollagen Gele19abgerufen werden.
Basierend auf diesem wissen, wertet diese Studie die SHG Signaländerungen induziert in der Sklera durch SMG chemisch induzierte Vernetzung von Kollagen. Die Ergebnisse zeigen, dass SMG Modifikation der Sklera die SHG-Signale aus Gewebe Kollagen Faserbündel (höhere Reihenfolge quartäre Struktur bestehend aus Kollagen-Fibrillen) hergestellt erhöht und auch einen morphologischen Strukturwandel im Kollagen produziert Glasfaser-Netzwerk, spiegelt sich in Faser Bundle “Aufrichtung.”
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimente haben gezeigt, Nachweise für die Verwendung der SHG Signal Mikroskopie als Methode für die Bewertung von Kollagen Vernetzung Effekte in der Lederhaut, Anhebung der zukünftigen Möglichkeit der Verwendung dieser Technik als Kontrollinstrument zur Vernetzung Behandlungen Das Ziel Kollagen Proteine. Der Hinweis ist ein Instrument bereits im klinischen Einsatz, die möglicherweise diese SHG Signal erfassen können. Obwohl dieses Instrument in erster Linie für bildgebende menschlichen Dermis der Haut entwickel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Tongalp Tezel, MD, für Beratung bei sT-Injektion; Theresa Swayne, PhD, für Beratung bei SHG Mikroskopie; und Jimmy Duong aus dem Design und Biostatistik-Ressource und die biostatistische zentrale Einrichtung des Irving Institute an der Columbia University Medical Center.
Teilweise unterstützt durch Forschung zur Erblindung verhindern und nationale Institute der Gesundheit Stipendien NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007 und NCI P30 CA013696 NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University besitzt damit verbundenen geistigen Eigentums: ausgestellt U.S. Patent keine: 8.466.203 und Nein: 9.125.856. International zum patent angemeldet: PCT/US2015/020276.
Bilder wurden in der Confocal gesammelt und spezialisiert Mikroskopie Shared Resource Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University, unterstützt von NIH gewähren #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Das konfokale Mikroskop angeschafft mit NIH #S10 RR025686 zu gewähren.
Materials
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
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