Påvisning af minimal eller målelige residual sygdom (MRD) er en vigtig prognostiske biomarkør for raffinering risikovurdering og forudsige tilbagefald i akut myeloid leukæmi (AML). Disse omfattende retningslinjer og anbefalinger med bedste praksis for konsekvente og nøjagtige identifikation og detektion af MRD, kan støtte effektive AML behandling beslutninger.
Svar kriterier i akut myeloid leukæmi (AML) er for nylig blevet genoprettet, med morfologiske undersøgelse udnyttet til at bestemme, om patienterne har opnået komplet remission (CR). Cirka vil halvdelen af de voksne patienter, som er indrejst CR tilbagefald indenfor 12 måneder på grund af udkommet af resterende AML celler i knoglemarven. Kvantitering af disse resterende leukæmiceller, kendt som minimal eller målelige residual sygdom (MRD), kan være en solid biomarkør for forudsigelse af disse tilbagefald. Retrospektiv analyse af flere undersøgelser har desuden vist, at tilstedeværelsen af MRD i knoglemarven af AML patienter korrelerer med dårlig overlevelse. Ikke alene er den samlede leukemic befolkning, afspejles af celler husly en leukæmi forbundet immun-fænotype (LAIP), forbundet med kliniske resultater, men så er de umodne lavfrekvente delpopulation af leukæmi stamceller (LSC), som begge kan være overvåget gennem flowcytometri MRD eller MRD-lignende metoder. Tilgængeligheden af følsomme assays, der muliggør påvisning af resterende leukæmiceller (stem) på grundlag af sygdoms-specifikke eller sygdom-associerede funktioner (unormal molekylære markører eller afvigende immunophenotypes) har drastisk forbedret MRD vurdering i AML. Men i betragtning af de iboende heterogenitet og kompleksiteten af AML som en sygdom, metoder til prøveudtagning knoglemarven og udføre MRD og LSC analyse bør harmoniseres når det er muligt. I dette manuskript vi beskrive en detaljeret metode til passende knoglemarvspunktat prøveudtagning, transport, prøve behandling for optimal flerfarvet flow flowcytometri vurdering, og gating strategier for at vurdere MRD og LSC til støtte i terapeutiske beslutningstagning for AML patienter.
Akut myeloid leukæmi (AML) er en malignitet i knoglemarven karakteriseret ved defekter i programmet modning med unormale spredning og ophobning af myeloide stamceller, hæmning af normale bloddannelsen, og i sidste ende knoglemarv svigt . Sygdommen er yderst heterogene morfologi, immunophenotype, cytogenetisk, Molekylær aberrationer og gen expression underskrifter samt behandlingsrespons og behandling resultatet1,2. Nuværende ledelse omfatter induktion kemoterapi med formålet at opnå komplet remission (CR), efterfulgt af efter remission behandling, som er i vid udstrækning styret af resultaterne af molekylære, cytogenetisk og immunophenotypic undersøgelser og består af enten flere kurser for yderligere kemoterapi eller (autologe eller allogene) stamcelle transplantation3. Trods høje remission satser efter intensiv kemoterapi i op til 90%, 5-års overlevelsen hos voksne er kun ca 30-40%, overvejende på grund af udviklingen af relapses, som er almindeligt resistente over for kemoterapi og dermed meget vanskelige at behandle. Resultatet i børn er bedre, selv om ca. en tredjedel også tilbagefald. Derfor, tidlig påvisning af overhængende tilbagefald vil udfylde et udækket medicinsk behov og kan lede efter remission terapi4.
Residual sygdom efter terapi kan afspejle summen af alle diagnose og efter diagnose modstand mekanismer/faktorer; Derfor kan dens måling være prognostiske og medvirkende til at lede behandling. Muligheden for defining residual sygdom (tidligere kaldet minimal residual sygdom og nu omhandlet som målelige residual sygdom eller MRD) langt under det morfologiske kriterium 5% blast celler er skiftende landskab af risiko classification. De to metoder for det meste bruges til at registrere MRD i øjeblikket flow flowcytometri-baserede og molekylær-baserede, sidstnævnte vil blive vurderet af reverse transkriptase PCR (RT-qPCR)5 eller selv i en tidlig fase af næste generation sequencing (NGS). Mange undersøgelser hos voksne såvel som børn vist allerede, at forskellige MRD tilgange giver stærke prognostiske oplysninger i AML både efter induktion og konsolidering terapi6,7, og en ny definition af sygdom byrde ( overlegen i forhold til morfologiske CR) er nu fremstår8. Dette tyder på, at MRD vurderet af flow og/eller molekylærbiologiske teknikker skal blive, og i virkeligheden er allerede ved at blive, standard i alle kliniske forsøg med AML.
Dette manuskript beskrives detaljeret flow flowcytometri procedure for at opnå en nøjagtig og reproducerbar immunophenotypic karakterisering af MRD i knoglemarven prøver, herunder knoglemarv prøveudtagning og behandlingen procedurer forud flowcytometri. Tilgængeligheden af god kvalitet knoglemarv prøver på diagnose og opfølgning er afgørende for succes af denne måling på tværs af kliniske websteder og kliniske forsøg. I virkeligheden, er disse pre analytiske overvejelser også af vital betydning for Molekylær (PCR og NGS) MRD tilgange. Immunophenotypic karakterisering af MRD kombineres anderledes udtrykt markører med normal myeloid og stamfader markører, til at identificere en leukæmi-associerede immunophenotype (LAIP)9. MRD måler resulterende af mange faktorer, der påvirker svar til terapi, som iboende eller erhvervede leukæmi medicinresistens, farmakodynamik og kinetik af terapi, immun overvågning og overholdelse. MRD er derfor en meget stærk efter diagnose prognostiske parameter tilknyttet klinisk resultat når dichotomized på en cut-off niveau bestemt af modtageren af drift karakteristiske (ROC) analyse. Vores voksen AML kohorte af HOVON 42a undersøgelse, cut-off er indstillet på 0,1% af LAIP positive celler/samlede hvide blodlegemer. Brug dette kriterium til bestemmelse af negative vs positive MRD status, kan en gruppe af patienter identificeres som har et betydeligt forværret relapse forekomsten, tilbagefald-omkostningsfrit og samlet overlevelse6. Derudover beskriver vi måling af umodne, resistente leukæmiceller med stamcelle-lignende funktioner (CD34 + CD38-leukæmi stamceller, eller LSC), som tilbyder en stærk prædiktor af patienten resultat10. Sammen LAIP og LSC tilgange form flow cytometric MRD tilgang. LAIP tilgangen er velegnet til ca 90% af patienterne, mens LSC tilgang kan anvendes i omkring 80% af patienterne. Sammen over 95% af patienterne kan evalueres for enten en parameter eller begge dele.
Endelig, denne publikation indeholder en detaljeret operationelle beskrivelse for at vurdere MRD ved flowcytometri. Dette omfatter: 1) harmonisering og/eller standardisering af knoglemarven prøveudtagningsprocedurer, 2) prøven transport vejledning 3) detaljeret beskrivelse af leukemic celle påvisning med FACS ved hjælp af flere antistof paneler herunder enkelt celle tube tilgange at karakterisere LSC, 4) set-up af FACS maskiner for standardiserede målinger, 5) analytiske programmer for MRD målinger og 6) analytiske programmer for LSC påvisning.
Vi tilstræber at vise alle facetter af proceduren herunder for prøveforberedelse, da der diskuteres sjældent, mens det er vigtigt for kvaliteten af det endelige resultat. Knoglemarvstransplantation aspiration og biopsi er kliniske procedurer, der anvendes til at evaluere den hæmatopoietisk celler i knoglemarven. Disse udføres sammen med en komplet blodtælling (CBC) og blod smear. Den optimale metode for knoglemarvstransplantation aspiration er afgørende for præcis diagnose og opfølgning for MRD måling. En vellykket knoglemarvspunktat indeholder derudover bør nok celler for at udføre LAIP, og LSC flow analyse (mindst 10 millioner levedygtige celler). Her beskriver vi metoden for at udføre en knoglemarvstransplantation aspiration og give retningslinjer, som bør resultere i passende celle prøveudtagning (og begrænse mulighederne for blodfortynding) behov for præcis diagnose og yderligere forskning. Disse præ analytiske overvejelser er også af vital betydning for Molekylær (PCR og NGS) MRD tilgange. Alle prøver for Immunofænotypning skal behandles fortrinsvis inden for 24 timer af samling. Selv om ikke anbefalelsesværdig, kan knoglemarv og perifert blodprøver stadig være behandlet og analyseret når der holdes op til 72 timer ved stuetemperatur. Derudover skal alle handlings med materialet udføres under sterile forhold, således at kryopræservering af sterile celler for senere forskning/kvalitetsvurdering etc.
Rigelig data er tilgængelige, viser bevis for MRD positivitet er forbundet med dårlig overlevelse, og derfor MRD vurdering kan forbedre patientens resultatet med yderligere prognostiske information hvorpå kliniske beslutninger kan træffes. En sammenhængende og harmoniseret metode til immuno-fænotypiske vurdering af MRD er derfor afgørende at i sidste ende forbedre patienternes terapi. Dette er også vigtigt, når man sammenligner kliniske studier på tværs af forskellige kliniske websteder, og kan i sidste ende hjælp i kliniske beslutning at gøre og tjener som en surrogat kliniske slutpunkt for samlet overlevelse. Forestillingen om, at solid retningslinjer er berettiget til nøjagtige og ensartede MRD målinger har ført til en samordnet indsats af europæisk leukæmi netværk (ELN) design topmoderne retningslinjer. Dette omfattende dokument vil blive offentliggjort sent-2017 og vil være medvirkende til mange studiegrupper og laboratorier bevæger sig fremad.
Kritiske trin i protokollen
En vigtig og ofte overset aspekt af MRD analyse er virkningen af prøven kvalitet på nøjagtig bestemmelse af MRD. Dette er mere synlige, når materialet skal transporteres til andre institutter i globale kliniske forsøg givet de yderligere operationelle overvejelser, der skal tages i betragtning i denne indstilling. For at mindske risikoen for blande patient er information og rettidig levering af prøver passende administration afgørende. Igen, på dette stadium af transport korrekte former og/eller indførsel til elektroniske hospitalssystemer med klare opgaver af den ønskede analyse er påkrævet. At bemærke stage på terapi af MRD prøveudtagning er også afgørende, da det kan være relevante for klinisk beslutningstagning (for eksempel efter andet kursus af terapi) og bør derfor defineres klart. Brug af mock data (som for eksempel januar 1 pr. fødselsår) øger risikoen for blande patienter eller analyser. Hvis det kræves af loven, bør en alternativ anonyme måde identifikationsmedlemsstaten anvendes.
Alle prøver for Immunofænotypning skal behandles fortrinsvis inden for 24 timer af samling. Selv om ikke anbefalelsesværdig, kan knoglemarv og perifert blodprøver stadig være behandlet og analyseret når der holdes op til 72 timer ved stuetemperatur. Derudover alle handlings med materialet kan bedst udføres under sterile betingelser, så yderligere kryopræservering af celler i (lokale) biobanker er fortsat relevante: mange kliniske undersøgelser har yderligere analyser for yderligere at undersøge leukæmiceller med respekt til molekylære, immuno-fænotypiske og funktionelle funktioner skal udføres på et senere tidspunkt. Detaljerne i biobanking er dog ikke omfattet af dette manuskript.
Bruge MRD som et diagnostisk redskab indebærer, at der skal et akkrediteret laboratorium, ikke kun for flowcytometri, men også hvad angår kvalitetskontrol af MRD vurdering. Dette kan kræve distribuere prøver til specifik referencelaboratorier eller (re) analyserer flow filer med MRD målinger af reference hold.
Denne artikel beskriver de vigtigste handlinger fra knoglemarven aspirat samling til bestemmelse af MRD i kliniske prøver – der kræver en hel gruppe af eksperter med specifikke opgaver, ansvarsområder, og med hyppige kommunikation til effektiv karakterisering og analyse. Da hver opgave er afgørende for proceduren, anbefales det at have god logistik herunder protokoller på hvert laboratorium og tilstrækkelig back-up personale, der er specielt uddannet til opgaven. Hertil kommer, da der er nogle relativt subjektive trin i en del af procedurerne (især LAIP, og LSC afvigende markør identifikation), er det vigtigt at have drøftelser om det endelige resultat af holdet, og har den endelige rapport er godkendt af et team af vejledere. Nuværende indsats forfølger computer softwareudvikling, der vil hjælpe med at standardisere (LAIP og LSC) MRD analyse.
Ændring og fejlfinding
Hvert lab kan have sit eget sæt af antistoffer, der kan bruges til at definere de forskellige delpopulationer, selv om at have en standardiseret rygraden af markører er afgørende for sammenlignelige resultater, som skitseret i ELN topmoderne retningslinjer for MRD målinger dokument nævnt ovenfor. Uanset de valgte markører, der er nogle spørgsmål, som kan vanskeliggøre analyse af resultaterne og skal tages i betragtning.
Begrænsninger af teknikken
Identifikation af LAIP, og LSC afvigende markør udtryk er først vurderes på diagnose og overvåges over tid (under og efter behandling) for nøjagtig karakterisering af MRD fænotype. Mens over 95% af patienterne kan blive evalueret via LAIP eller LSC (eller begge), stadig nogle patienter har ingen definerede LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs eller præsentere med CD34 negative eksplosioner, eller har en manglende diagnose prøve. I disse tilfælde, er det stadig værd at forsøge at måle MRD med et panel af antistoffer så bredt som antallet ledige celler giver mulighed for og derefter vælge den mest pålidelige (giver den stærkeste skelnen mellem leukemic celler) LAIP. I betragtning af at en del af de patienter, der i sidste ende tilbagefald ikke helt ligner diagnose immunophenotype, på grund af heterogenitet af AML sygdom, måle et bredt panel af antistoffer på MRD anbefales under alle omstændigheder. Disse immunophenotypic forskydninger omfatter blast celler og LSCs og har vist sig at forekomme under terapi16 og den målbare sygdom kan være baseret på disse såkaldte kommende populationer. På dette tidspunkt dog er det ikke fastslået, om alle immunophenotypic delpopulationer vil føre til sygdom tilbagefald, og er derfor ikke almindelig praksis at rapportere MRD skræddersyet-terapi baseret på disse celler i kliniske forsøg. Det er vigtigt at bemærke, at risikoen for manglende LSC på grund af befolkningen forskydninger er reduceret med en tube tilgang, hvor de vigtigste aberrancy definerende markører er i én flowcytometri (PE) kanal14.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
De i denne protokol beskrevne metode bygger på definitionen af en eller flere LAIPs, hvilke celler der følges under terapi. En ulempe ved denne metode er, at det har for nylig vist sig at LAIP kan ændres under behandlingen. Denne måde nogle kommende populationer med forskellige afvigende markører kan blive savnet. For at omgå dette, ville det være bedst at måle alle afvigende markører i stedet for kun dem, der findes på diagnosen. Dette ville derefter være svarende til den “forskellige fra normal” fremgangsmåde, der bruges af flere laboratorier17.
Fremtidige ansøgninger
For nylig, MRD har fået ekstra opmærksomhed for romanen kliniske forsøgsdesign. I æra af specialiserede behandlingsmuligheder og målrettede medicinsk behandling, brugen af MRD som et resultat foranstaltning vil reducere den tid, det tager at etablere klinisk effekt af nye behandlinger, i sidste ende giver mulighed for hurtigere indførelse af et presserende behov for terapeutisk muligheder i klinikken. Betydningen af passende logistik og praktisk udførelse af en harmoniseret MRD vurdering er afgørende for fremtidig AML behandling succes som FDA undersøger i øjeblikket muligheden for at bruge MRD som en surrogat slutpunkt i stedet for samlet overlevelse måler18.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning har været støttet af hollandske Cancer Society (ALPE 2013-6371) og Egbers foundation for VONK. Vi takker den hollandske AML-MRD arbejdsgruppe for samarbejdet og frugtbare drøftelser for kontinuerlig forbedring og standardisering af AML-MRD.
BD Biosciences | 120995496,060996589 and 013729 | FACS Canto II | |
BD Biosciences | 555360 | CD7 FITC | |
DAKO | F076701 | CD2 FITC | |
Sanquin | M1613 | CD36 FITC | |
BD Biosciences | 332778 | CD15 FITC | |
BD Biosciences | 335039 | CD45RA FITC | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345785 | CD14 PE | |
Miltenyi Biotec | 130-080-801 | CD133 PE | |
BD Biosciences | 562566 | Clec12a PE | |
BD Biosciences | 565568 | Tim-3 PE | |
BD Biosciences | 332774 | CD7 PE | |
BD Biosciences | 333142 | CD11b PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 347222 | CD34 PERCP-CY5.5 | |
BD Biosciences | 558714 | CD123 PERCP-CY5.5 | |
Beckman Coulter | B49221 | CD117 PE-CY7 | |
BD Biosciences | 562854 | CD33 BV421 | |
BD Biosciences | 345791 | CD19 APC | |
BD Biosciences | 333143 | CD11b APC | |
BD Biosciences | 345800 | CD33 APC | |
BD Biosciences | 345807 | CD38 APC | |
BD Biosciences | 641411 | HLA-DR APC-H7 | |
BD Biosciences | 560532 | CD44 APC-H7 | |
BD Biosciences | 562596 | CD13 BV421 | |
BD Biosciences | 348811 | CD34 PE-CY7 | |
Beckman Coulter | A96416 | CD45 Krome Orange | |
BD Biosciences | 655873 | CD45 HV500c | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | 555899 | Pharm lysing solution | |
BD Biosciences | 644204 | Multicolor CompBeads | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | FACSDiva software | ||
Cytognos | Infinicyt | ||
Spherotech | Euroflow RCP-30-5a | ||
Sigma-Aldrich | Tuerk solution | ||
Spherotech | BCP-100-5 | Blank Calibration Particles Beads | |
HSA | |||
Azide | |||
ddH2O |