Oppdagelsen av minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD) er en viktig prognostiske biomarkør for raffinering risikovurdering og forutsi tilbakefall i akutt myelogen leukemi (AML). Disse omfattende retningslinjer og anbefalinger med beste praksis for konsekvent og nøyaktig identifikasjon og påvisning av MRD, kan hjelpe i å gjøre effektiv AML behandlingen avgjørelser.
Svar vilkår i akutt myelogen leukemi (AML) har nylig blitt re-etablert, med morfologiske undersøkelse benyttes for å fastslå om pasienter har oppnådd fullstendig forlatelse (CR). Omtrent vil halvparten av de voksne pasientene som angitt CR tilbakefall innen 12 måneder på grunn av resultatet av gjenværende AML cellene i benmargen. Kvantifisering av disse gjenværende leukemi celler, kalles minimal eller målbare gjenværende sykdom (MRD), kan være en robust biomarkør for prediksjon av disse relapses. Videre har retrospektiv av flere studier vist at tilstedeværelsen av MRD i benmargen av AML pasienter korrelerer med dårlig overlevelse. Ikke bare er leukemic befolkningen, reflektert av cellene skjuler en leukemi forbundet immun-fenotypen (LAIP), tilknyttet kliniske utfallet, men så er de umodne lavfrekvente subpopulasjon av leukemi stamceller (Lexmarks Løsningssenter), begge kan være overvåkes gjennom flowcytometri MRD eller MRD-lignende tilnærminger. Tilgjengeligheten av sensitive analyser at påvisning av gjenværende leukemi (stem) celler på grunnlag av sykdom-spesifikke eller sykdomsassosierte funksjoner (unormal molekylære markører eller avvikende immunophenotypes) har drastisk forbedret MRD vurdering i AML. Men bør gitt den iboende heterogenitet og kompleksiteten i AML som en sykdom, metoder for prøvetaking benmargen og MRD og Lexmarks Løsningssenter analyse være harmoniserte når mulig. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert metodikk for tilstrekkelig benmarg leveringstanken prøvetaking, transport, prøve behandling for optimal multi-farge flyt cytometri vurdering og gating strategier for å vurdere MRD og Lexmarks Løsningssenter for å hjelpe i terapeutisk beslutningsprosesser for AML pasienter.
Akutt myelogen leukemi (AML) er en malignancy av benmargen preget av feil i modning programmet, med unormal spredning og akkumulering av myeloid progenitor celler, hemming av vanlige hematopoiesis, og til slutt benmarg feil . Sykdommen er svært heterogen forhold til morfologi, immunophenotype, cytogenetics, molekylær avvik og genuttrykk signaturer og behandlingsrespons og behandlingen utfallet1,2. Nåværende ledelsen inkluderer induksjon kjemoterapi med sikte på å oppnå komplett forlatelse (CR), etterfulgt av etter remission behandling, i stor grad styrt resultatene av molekylære, cytogenetic og immunophenotypic studier og består av enten flere kurs av flere kjemoterapi eller (autologous eller allogene) stilk cellen transplantasjon3. Til tross for høy remisjon priser etter intensiv kjemoterapi for opptil 90%, 5-års overlevelse hos voksne er bare ca 30% – 40%, hovedsakelig på grunn av utviklingen av tilbakefall som er vanligvis motstandsdyktige mot kjemoterapi og dermed svært vanskelig å behandle. Utfallet i barn er bedre, men omtrent en tredjedel også tilbakefall. Derfor tidlig deteksjon av overhengende tilbakefall fyller et udekket medisinske behov og kan veilede etter remission terapi4.
Gjenværende sykdom etter terapi kan gjenspeile summen av alle diagnose og etter diagnose motstand mekanismer/faktorer; Dermed kan sin måling være prognostiske og instrumentale for guiding behandling. Muligheten for defining gjenværende sykdom (tidligere kalt minimal gjenværende sykdom og nå referert til som målbare gjenværende sykdom eller MRD) langt under morfologiske nødvendighetskriteriet 5% blast celler endrer landskapet av risiko classification. For tiden de to metodene hovedsakelig brukes til å oppdage MRD er flyt cytometri- og molekylær-baserte, sistnevnte blir vurdert av revers transkriptase PCR (RT-qPCR)5 eller, men i et tidlig stadium av neste generasjons sekvensering (NGS). Mange studier hos voksne også som barn vist allerede at ulike MRD tilnærminger gir sterk prognostiske informasjon i AML både etter induksjon og konsolidering terapi6,7, og en ny definisjon av sykdom byrde ( overordnet morfologiske CR) fremstår nå8. Dette tyder på at MRD vurdert av flyt og/eller molekylær teknikker bør bli, og faktisk allerede blitt, standard i alle kliniske i AML.
Dette manuskriptet diskuterer detaljerte flyt cytometri prosedyren for å få en nøyaktig og reproduserbar immunophenotypic karakteristikk av MRD i benmargen prøver, inkludert beinmargen prøvetaking og behandling prosedyrer foregående flowcytometri. Tilgjengeligheten av god kvalitet benmarg samples ved diagnostisering og oppfølging er avgjørende for suksessen til denne målingen over kliniske områder og kliniske studier. Faktisk er disse pre analytisk også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD. Immunophenotypic karakteristikk av MRD, er aberrantly uttrykt indikatorer kombinert med normal myelogen og stamfar markører, til å identifisere en leukemi-assosiert immunophenotype (LAIP)9. MRD måler resulterende av mange faktorer som påvirker svar terapi, som innebygd eller ervervet leukemi resistens, pharmacodynamics og kinetics terapi, immun overvåking og etterlevelse. MRD er derfor en veldig sterk etter diagnose prognostiske parameter tilknyttet kliniske utfallet når dichotomized på cut-off nivå bestemmes av mottakeren drift karakteristisk (ROC) analyse. For våre voksen AML kohort av HOVON 42a studere, cut-off settes på 0,1% LAIP positive celler/totalt hvite blodlegemer. Bruker dette kriteriet for å bestemme negative vs positiv MRD status, kan en gruppe pasienter identifiseres som har en betydelig dårligere tilbakefall forekomsten, tilbakefall-fri og total overlevelse6. I tillegg beskriver vi måling av umoden, resistente leukemi celler med stilk cellen-lignende funksjoner (CD34 + CD38-leukemi stamceller eller Lexmarks Løsningssenter), som gir en sterk prediktor for pasient utfall10. Sammen LAIP og Lexmarks Løsningssenter tilnærminger skjemaet flyt cytometric MRD tilnærming. LAIP tilnærmingen passer for omtrent 90% av pasienter, mens Lexmarks Løsningssenter tilnærming kan brukes i ca 80% av pasientene. Sammen over 95% av pasientene kan vurderes for en parameter eller begge.
Til slutt gir denne publikasjonen en detaljert operative beskrivelse for å vurdere MRD av flowcytometri. Dette inkluderer: 1) harmonisering og/eller standardisering av benmarg utvalgstrekking, 2) eksempel transport veiledning 3) detaljert beskrivelse av leukemic celle gjenkjenning med FACS bruker flere antistoff panelene inkludert enkeltcelle tube tilnærminger å karakterisere Lexmarks Løsningssenter, 4) oppsett av FACS maskiner for standardisert målinger, 5) analyseprogrammer for MRD målinger og 6) analyseprogrammer for Lexmarks Løsningssenter gjenkjenning.
Vi tar sikte på å vise alle fasetter av prosedyren inkludert eksempel utarbeidelsen siden som er sjelden diskutert mens det er en viktig sak for kvaliteten på det ultimate resultatet. Benmarg aspirasjon og biopsi er kliniske prosedyrer brukes til å evaluere blodkreft cellene i benmargen. Dette utføres sammen med en full blodstatus (CBC) og blodutstryk. Den optimale metoden for benmarg aspirasjon er avgjørende for nøyaktig diagnose og oppfølging for MRD måling. I tillegg inneholde en vellykket benmarg leveringstanken nok celler for å utføre LAIP og Lexmarks Løsningssenter flyt analyse (minst 10 millioner levedyktig celler). Her beskriver vi metoden for å utføre en benmarg aspirasjon og gi retningslinjer, som skal resultere i tilstrekkelig celle utvalg (og grense potensialet for hemodilution) behov for nøyaktig diagnostikk og ytterligere forskning. Disse pre analytiske vurderinger er også av avgjørende betydning for molekylær (PCR og NGS) MRD tilnærminger. Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg bør alle handlings med materialet utføres under sterile forhold, for å aktivere kryonisk bevaring av sterile celler for senere forskning/kvalitetsvurdering osv.
God data er tilgjengelig som viser bevis for MRD positivitet å være assosiert med dårlig overlevelse, og derfor MRD vurdering kan forbedre pasient utfall av gir deg prognostiske informasjon som klinisk beslutninger kan gjøres. Derfor er en konsekvent og harmoniske metode for immuno-fenotypiske vurdering av MRD viktig til slutt forbedre pasientens terapi. Dette er også viktig når du sammenligner kliniske studier over forskjellige kliniske områder, og kan til slutt hjelp i klinisk beslutningsstøtte gjør og tjene som et surrogat klinisk endepunkt for total overlevelse. Forestillingen om at solid retningslinjer er berettiget for nøyaktig og konsekvent MRD målinger har ført til en felles handling av europeiske leukemi nettverk (ELN) design toppmoderne retningslinjer. Denne omfattende dokument blir publisert sent-2017, og vil være instrumentell for mange kollokvier og laboratorier fremover.
Avgjørende skritt i protokollen
En viktig og ofte oversett del av MRD analyse er effekten av prøven kvalitet på nøyaktig bestemmelse av MRD. Dette er tydeligere når materialet har å bli transportert til andre institutter i globale kliniske forsøk gitt de ekstra driftsmessige hensyn som må tas hensyn til i denne innstillingen. For å redusere risikoen for å blande opp pasienten er informasjon og rettidig levering av prøver tilstrekkelig administrasjonen avgjørende. Igjen, på dette stadiet av transporten den korrekte former og/eller import i elektronisk sykehus systemer med klart tildelinger forespurte analysen er nødvendig. Merke scenen ved behandling av MRD prøvetaking er også avgjørende siden det kan være relevant for klinisk beslutningsstøtte (for eksempel etter andre løpet av terapi) og bør derfor defineres klart. Bruk av uekte data (som for eksempel januar 1 per fødselsår) øker risikoen for å blande opp pasienter eller analyser. Hvis påkrevet ved lov, bør en alternativ anonymisert måte legitimasjon brukes.
Alle prøver for immunophenotyping bør behandles fortrinnsvis innen 24 timer av samlingen. Selv om det ikke anbefales, kan benmargen og eksterne blodprøver fortsatt behandles og analysert når holdt opptil 72 h ved omgivelsestemperatur. I tillegg alle handlings med materialet kan best utføres under sterile forhold, slik at ytterligere kryonisk bevaring av celler i (lokal) biobanker fortsatt relevante: mange kliniske studier har flere analyser til å undersøke nærmere leukemi celler med respekt til molekylær immuno-fenotypiske og funksjonelle funksjoner som skal utføres på et senere tidspunkt. Men detaljene for biobanking er ikke innenfor dette manuskriptet.
Bruke MRD som et diagnostisk verktøy innebærer at det må akkreditert laboratorium, ikke bare for flowcytometri, men også om kvalitetskontroll av MRD vurdering. Dette krever distribusjon prøver å spesifikk referanse laboratorier eller (re) analysere flyt filer med MRD målinger av referanse.
Denne artikkelen beskriver de viktigste handlingene fra benmargen leveringstanken samling til fastsettelse av MRD i klinisk prøver – krever en hele team av eksperter med bestemte oppgaver, ansvar, og hyppige kommunikasjon for effektiv karakterisering og analyse. Siden hver aktivitet er avgjørende for prosedyren, anbefales det å ha lyd logistikk inkludert protokoller ved hvert laboratorium og tilstrekkelig sikkerhetskopi personell som er spesielt opplært på aktiviteten. I tillegg, siden det er noen relativt subjektive trinn delvis av prosedyrer (spesielt LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør identification), er det viktig å ha diskusjoner om resultatet av teamet, og har den endelige rapporten er godkjent av et team av veiledere. Dagens innsats arbeider computer software utvikling som vil bidra til å standardisere (LAIP og Lexmarks Løsningssenter) MRD analysen.
Modifikasjon og feilsøking
Hver lab kan ha sitt eget sett av antistoffer som kan brukes til å definere de forskjellige subpopulasjoner selv om å ha en standardisert ryggrad av markører er avgjørende for sammenlignbare resultater, som beskrevet i ELN toppmoderne retningslinjer for MRD målinger dokument nevnt over. Uansett valgte markører det er noen problemer som kan gjøre analyse av resultatene vanskelig og må tas i betraktning.
Begrensninger av teknikken
Identifikasjon av LAIP og Lexmarks Løsningssenter avvikende markør uttrykk er først vurdert på diagnose og overvåket over tid (under og etter terapi) for nøyaktig karakteristikk av MRD fenotypen. Mens over 95% av pasientene kan evalueres via LAIP eller Lexmarks Løsningssenter (eller begge), fortsatt noen pasienter har ingen definerte LAIPs eller ingen CD34 + CD38-LSCs presentere CD34 negative støt eller har en manglende diagnose prøve. I disse tilfellene, er det fortsatt verdt å prøve å måle MRD med et panel av antistoffer bredt som antall tilgjengelige celler tillater og velg den mest pålitelige (gir sterkeste æren av leukemic celler) LAIP. Vurderer at en andel av pasienter som til slutt tilbakefall ikke helt ligner diagnose immunophenotype, på grunn av heterogenitet AML Disease, måle et bredt panel av antistoffer i MRD anbefales allikevel. Disse immunophenotypic Skift blast celler og LSCs og har vist seg å oppstå under terapi16 og measureable sykdommen kan være basert på disse såkalte kommende populasjoner. Denne gangen men er det ikke fastslått om alle immunophenotypic Sub-populasjoner vil føre til sykdommen tilbakefall, og er derfor ikke vanlig praksis å rapportere MRD skreddersydd-terapi basert på disse cellene i kliniske forsøk. Det er viktig å merke seg at risikoen for manglende Lexmarks Løsningssenter på grunn av befolkningen Skift er redusert av en tube tilnærming som den viktigste aberrancy definere markører er i en flowcytometri (PE) kanal14.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder
Metoden beskrevet i denne protokollen er avhengig av definisjonen av en eller flere LAIPs, hvilke celler følges under behandling. En ulempe med denne metoden er at det har nylig vist at LAIP kan endres i løpet av terapi. Denne måten noen kommende populasjoner med forskjellige avvikende indikatorer kan være savnet. For å omgå dette, ville det være best å måle alle avvikende markører i stedet for bare de på diagnose. Dette vil da være lik “annerledes fra vanlig” tilnærmingen som brukes av flere laboratorier17.
Framtidige applikasjoner
MRD har nylig fått ekstra oppmerksomhet for romanen klinisk prøve design. I æra av spesialiserte behandlingstilbud og målrettet medikamentell behandling, bruk av MRD som et resultat tiltaket vil redusere tiden det tar å opprette klinisk effekt av romanen behandlinger, til slutt slik at raskere innføring av haster terapeutiske alternativer i klinikken. Betydningen av aktuelle logistikk og praktisk effektuering av en harmonisert MRD vurdering er avgjørende for fremtidige AML suksess som FDA er for tiden undersøker muligheten for å bruke MRD som et surrogat endepunkt i stedet for total overlevelse måler18.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har blitt støttet av hollandske Kreftforeningen (ALPE 2013-6371) og Egbers grunnlag for VONK. Vi takker nederlandske AML-MRD arbeidsgruppen for samarbeid og fruktbart diskusjoner for kontinuerlig forbedring og standardisering av AML-MRD.
BD Biosciences | 120995496,060996589 and 013729 | FACS Canto II | |
BD Biosciences | 555360 | CD7 FITC | |
DAKO | F076701 | CD2 FITC | |
Sanquin | M1613 | CD36 FITC | |
BD Biosciences | 332778 | CD15 FITC | |
BD Biosciences | 335039 | CD45RA FITC | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345785 | CD14 PE | |
Miltenyi Biotec | 130-080-801 | CD133 PE | |
BD Biosciences | 562566 | Clec12a PE | |
BD Biosciences | 565568 | Tim-3 PE | |
BD Biosciences | 332774 | CD7 PE | |
BD Biosciences | 333142 | CD11b PE | |
BD Biosciences | 337899 | CD22 PE | |
BD Biosciences | 345810 | CD56 PE | |
BD Biosciences | 347222 | CD34 PERCP-CY5.5 | |
BD Biosciences | 558714 | CD123 PERCP-CY5.5 | |
Beckman Coulter | B49221 | CD117 PE-CY7 | |
BD Biosciences | 562854 | CD33 BV421 | |
BD Biosciences | 345791 | CD19 APC | |
BD Biosciences | 333143 | CD11b APC | |
BD Biosciences | 345800 | CD33 APC | |
BD Biosciences | 345807 | CD38 APC | |
BD Biosciences | 641411 | HLA-DR APC-H7 | |
BD Biosciences | 560532 | CD44 APC-H7 | |
BD Biosciences | 562596 | CD13 BV421 | |
BD Biosciences | 348811 | CD34 PE-CY7 | |
Beckman Coulter | A96416 | CD45 Krome Orange | |
BD Biosciences | 655873 | CD45 HV500c | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | 555899 | Pharm lysing solution | |
BD Biosciences | 644204 | Multicolor CompBeads | |
BD Biosciences | 655051 | CST beads | |
BD Biosciences | FACSDiva software | ||
Cytognos | Infinicyt | ||
Spherotech | Euroflow RCP-30-5a | ||
Sigma-Aldrich | Tuerk solution | ||
Spherotech | BCP-100-5 | Blank Calibration Particles Beads | |
HSA | |||
Azide | |||
ddH2O |