Hele celle strøm av Puff søknad GABA i hjernen skiver
Summary
Vi beskriver puff teknikken, som farmakologisk reagenser kan administreres under hele celle patch-klemme opptak, og fremheve ulike sider av funksjonene som er avgjørende for suksessen.
Abstract
Farmakologiske administrasjon brukes vanligvis når du utfører hele celle patch-klemme i hjernen skiver. En av de beste metodene for medikament programmet elektrofysiologiske innspillingen er puff teknikken, som kan brukes til å studere effekten av farmakologiske reagenser på neuronal aktiviteter i hjernen skiver. Den største fordelen med puff programmet er at stoffet konsentrasjonen rundt innspillingen området øker raskt, dermed hindre foreskrevet membran reseptorer. Vellykket bruk av puff søknad innebærer oppmerksomheten følgende elementer: konsentrasjonen av stoffet, parameterne for puff brønnene, avstanden mellom spissen av puff brønnene og Nevron registrert og varighet og Trykk kjøring puff (pounds per kvadrattomme, psi). Denne artikkelen beskriver en trinnvis fremgangsmåte for opptak hele celle strøm av damper gamma – aminobutyric acid (GABA) på en Nevron en prefrontal kortikale sektoren. Spesielt kan den samme fremgangsmåten brukes med mindre modifikasjoner til andre hjernen områder som hippocampus og striatum og forskjellige preparater, som cellekulturer.
Introduction
Patch-klemme teknikken, hovedverktøy for å undersøke elektriske signaler i neurons, ble utviklet på 1970-tallet1,2. En stor fordel av denne teknikken er at den gir kunnskap om hvordan bestemte behandlinger (f.eks farmakologiske) kan endre neuronal funksjoner eller kanaler i sanntid3. Farmakologiske evaluering av neuronal funksjonen under hele celler i et hjernen stykke krever at programmet av stoffer som agonister eller antagonister av spesifikke reseptorer, neurons registreres. Denne metoden tillater identifikasjonen nevronale endringer som oppstår etter bruk av et bestemt legemiddel, dermed fører til en bedre forståelse av fysiologiske og patologiske egenskapene av neurons4. Selv om farmakologiske administrasjon kan utføres via enten perfusjon5 eller blåse6, er sistnevnte overlegen teknikken. Spesielt: (i) puff søknad raskt øker narkotika konsentrasjon rundt innspilte Nevron til et nivå slik at desensitization av membran reseptorer deaktiveres; (ii) volumet av narkotika andpusten er ekstremt lav, slik at det er liten effekt på bad løsningen, noe som dermed reduserer eventuelle uønskede effekter av administrert kjemikaliene på hjernen skiver; (iii) puff protokollen kan være satt og lagret, gjør eksperimentet meget presist reproduserbar; (iv) puff søknad representerer økonomisk bruk av agonister/antagonister, spesielt hvor slike reagenser er dyrere eller vanskeligere å få.
Her vil vi fokusere på opptak hele celle strøm av damper GABA i akutt forberedt hjernen skiver, et preparat som har fordelen av relativt godt bevart hjernen kretser. Hvordan vi utfører puff-indusert hemmende strøm7 vil bli beskrevet i denne artikkelen. Ved hjelp av cesium (Cs+)-baserte intern løsninger og holde neurons 0 mV, vil vi presentere GABA blåse utløste hemmende postsynaptic strøm (eIPSCs) med passende tekniske detaljer. Bruke en musemodell av depresjon indusert av lipopolysakkarid (LPS) injeksjon8, vi viser at eIPSC er amplitude fremkalt av en GABA puff betydelig redusert i skiver av LPS-injisert mus forhold til bilen kontroller. Vår intensjon er at denne artikkelen skal vise hvordan puff teknikken er vidt gjelder studier vurdere effekten av kjemikalier, stoffer eller medikamenter på neuronal aktiviteter i hjernen skiver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puff søknad er mye brukt til å evaluere postsynaptic reseptor funksjonen3,4,7, men krever presis kontroll hvert eksperiment. Her beskriver vi en prosedyre som involverer hele celle oppdateringen clamping, som viser GABA blåse indusert IPSCs (dvs. eIPSCs) i prefrontal kortikale hjernen skiver. Motstanden av opptak elektroden er ca 5 MΩ, mens tuppens diameter av puff Mikropipetter handler om 2-5 µm. Puff trykket mellom 4-6 ps…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne gjerne takke følgende organisasjoner: National Natural Science Foundation i Kina (31171018, 31171355), vitenskap og teknologi divisjon i Guangdong (2013KJCX0054), Natural Science Foundation av Guangdongprovinsen ( 2014A030313418, 2014A030313440), og Guangzhou vitenskap og teknologi Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
