Denne protokol er at restituere sig og forberede Molekylær genetisk karakterisering på niveauet encellede sjældne målceller fra en blanding med ikke-målarter baggrund celler. DNA kvalitet er lig med ubehandlede enkelt celler og giver mulighed for enkelt-celle ansøgning (begge screening baseret og målrettet analyse).
Sjældne target-cellerne kan isoleres fra en stor baggrund af ikke-målarter celler ved hjælp af antistoffer specifikke for overflade proteiner af target-cellerne. En nyligt udviklede metode bruger en medicinsk wire functionalized med anti-epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM) antistoffer for i vivo isolation af cirkulerende tumor celler (CTCs)1. En patient-matchede kohorte i ikke-metastatisk prostatacancer viste, i vivo isolation teknik resulterede i en højere procentdel af patienterne positiv for CTCs samt højere CTC tæller i forhold til den nuværende guld standard i CTC optællingen. Som cellerne ikke kan inddrives fra aktuelle medicinsk udstyr, blev en ny functionalized wire (benævnt enhed) fremstillet tillader opsamling og efterfølgende udstationering af celler af enzymatisk behandling. Celler er tilladt at tillægge enheden, visualiseret på et mikroskop og adskilt ved hjælp af enzymatisk behandling. Gendannede celler er cytocentrifuged på membran-belagt dias og høstet individuelt ved hjælp af laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver underkastes derefter encellede samlede genom forstærkning tillader flere downstream analyse herunder screening og target-specifikke tilgange. Proceduren for isolation og recovery giver høj kvalitet DNA fra enkelt celler og forringe ikke efterfølgende hele genom forstærkning (WGA). En enkelt celle amplificerede DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som array sammenlignende genom hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheden tillader ex vivo isolation fra kunstige sjældne celle prøver (dvs. 500 målceller spidse til 5 mL af perifert blod). Detachement satser af celler er acceptabel (50-90%), genfindingsprocenten for fritliggende celler på dias spænder over en bred vifte afhængig af cellelinie anvendes ( 50%) og har brug for nogle yderligere opmærksomhed. Denne enhed er ikke markeret til brug i patienter.
For nylig, CellCollector DC01, en medicinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer til at isolere CTCs fra perifert blod af kræftpatienter, blev tilføjet til den metodisk spektrum af CTC tælling1,2,3 . I en igangværende undersøgelse i ikke-metastatisk prostatacancer, denne functionalized wire rapporterer næsten dobbelt så mange patienter at være CTC-positive og højere CTC tæller i CTC-positive patienter i forhold til CellSearch, den gyldne standard i CTC optællingen3 . På grund af denne opmuntrende resultater, dyrkning af celler fra en functionalized medicinsk ledning til enkelt-celle analyse ville være ønskeligt, men hverken enzymatisk behandling med celle detachement løsninger (f.eks. trypsin) eller laser microdissection giver mulighed for inddrivelse af intakt celler (data ikke vist).
For at tillade udstationering af erobrede celler, var en ny generation af functionalized ledninger udstyret med en specifik polymer. Denne polymer, der forbinder capture-antistoffer til wire, er modtagelige for en frigivelse buffer behandling tillader udstationering af intakt celler (CellCollector DC03 omtales som enhed). Den nye functionalized indretning, giver isolation af target-cellerne fra forskellige koncentrationer af kræft celle linje celler spidse til bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For at lette den visuelle påvisning af celler på enheden og efter opsving, målrette kræftceller er mærket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA pletten før inddrive behandling (dvs. opladning og afmonterer). Den behandling effekter på DNA kvaliteten af enkelt celler ved hjælp af en kvalitetskontrol PCR4,5, array-CGH6,7 tidligere, blev evalueret efter WGA og målrettet sekventering7 viser ingen forskel i forhold til ubehandlede celler micromanipulated fra celle suspensioner7. Fordelen ved denne metode ligger i kombinationen af sjældne målcellen pre berigelse og inddrivelse af celler til én celle downstream analyse (figur 1). Den nuværende CE-mærket i vivo samling enhed er generelt bruges til optælling af CTCs i stedet for én celle Molekylær karakterisering2,8. Dog mere omfattende analyse at undersøge heterogenitet blandt CTCs længe til analyse på den enkelte celle niveau (dvs. målrettet sekventering på én celle-niveau). Andre cell-baserede metoder er baseret på immunomagnetic isolation af EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering baseret på dielektroforesis for efterfølgende Molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering af CTCs er en vigtig forudsætning for deres nyttige gennemførelse i kliniske omgivelser og er lige så vigtige for grundforskning af metastatisk cascade. Parallelt med CTCs, er cirkulerende tumor DNA (ctDNA) blevet af stor betydning, da det giver mulighed for DNA analyse af tumor byrde med minimal teknisk isolering procedurer11,12. Celle-baserede tilgange kan tjene som et supplerende bidrag, da det giver mulighed for RNA13,14 og protein15 udtryk analyse og også for CTC stammer celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om forhindringer såsom lav celle opsving og clearance til brug hos patienter skal stadig overvindes, metoden fangst- og frigivelse tager et vigtigt næste skridt til karakterisering af sjældne target-cellerne.
Den beskrevne protokollen tager sigte på hentning af celler fra en functionalized wire (benævnt enhed) til ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testede tre EpCAM-positive cellelinjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i princippet, denne metode kan anvendes til enhver cellelinje at udtrykke EpCAM. EpCAM-positive target-cellerne kan forelægges enhed som ren cellesuspension (Se 2.1.) eller blandet i et overskud af baggrunden celler (fx. perifere blod, se 2.2.). Især sidstnævnte kan anvendes til at teste isolation kapacitet sjældne celle betingelser, finjustering af antallet celler knyttet til wire kan gøres ved hjælp af den beskrevne lav-volumen tilgang (se punkt 2.3.). Da forskellene mellem cellelinjer forventes, hastighed egnet celle tætheder for opladning wire, rotation såvel som inkubationstiden skal afprøves empirisk ved at vurdere antallet af tilknyttede celler ved hjælp af en immunofluorescens mikroskop.
For genomisk downstream programmer på én celle niveau WGA, er påkrævet. WGA metoden variere mellem labs, og i princippet vores metode er åben for alle metoder end kan håndtere prøver fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokol bruger vi en metode baseret på enzymatisk fragmenterede DNA på grund af en bedre ydeevne sammenlignet med en varme-fragmentering baseret WGA7. Valgfri, enkelt celler kan videresendes til isotermisk WGA giver mulighed for efterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tager sigte på at inddrive intakt celler efter at være knyttet til en ny generation af functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generation af functionalized ledninger, som også repræsenterer kun CE-godkendt i vivo berigelse enheder på markedet indtil videre, blev brugt til optælling af CTCs i spredt sig i kroppen kræftpatienter. Tidligere publikationer og vores egne data tyder i vivo isolation teknik for at være mere følsom i forhold til den nuværende guld standard teknologi2. Således tillader udstyre denne i vivo isolation teknik med en funktion til dokumentgendannelse, som realiseret i enheden kombinerer høj CTC opsving med karakterisering på én celle-niveau.
Men enheden er ikke blevet godkendt til brug hos patienter, således kliniske data er ikke tilgængelige. Ex vivo applikationer (dvs isolere CTCs fra perifert blod efter prøvetagning) ikke anbefales som teknologien er tilpasset til de indstillinger, der er til stede i kubiske forgæves, fx lave diameteren af den forfængelige (øge sandsynligheden for direkte kontakt mellem CTCs og fange antistoffer) og lang opholdstid (30 min, så 2-3 L blod til at passere ledningen). Men som beskrevet i afsnit 2.2. target-cellerne kan også isoleres fra blandet prøver7.
En nuværende begrænsning af metoden er ineffektiv inddrivelse af optagne celler efter løsrivelse fra ledningerne. Dette, kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering skridt før udstationering behandling.
I Resumé er denne protokol et første skridt mod den kombinerede brug af en i vivo isolation teknik med celle opsving for genetisk karakterisering af enkelt celler. Yderligere indsats at løse optimering af celle opsving og regnskabsafslutning for dens anvendelse i patienter1,2. Personlig medicin til behandling overvågning og terapi afgørelser er dog ud over optælling af CTCs. Således, denne metode er et første skridt i retning af genomisk CTC karakterisering på det enkelte celle niveau.
Programmer mod encellede transkriptom analyse synes muligt som intakt celler er høstet. Det er imidlertid vurderes, om proceduren for inddrive indvirker på RNA integritet (f.eks. forwarding gendannede enkelt celler til direkte lysis efterfulgt af RT-qPCR22). Hvis det lykkes, kan karakterisering af enkelt celler (f.eks. CTCs) være flyttet til transkriptom niveau, giver mulighed for mere detaljerede analyser. I denne henseende, RNA-seq ved hjælp af Smart-seq2 giver et værdifuldt redskab for RNA downstream analyse af enkelt celler som den preamplified cDNA (opnået under RNA-seq bibliotek forberedelse) kan blive udsat for kvantitativ PCR. Dette vil give mulighed for en kombineret mål og screening-baseret analyse af enkelt gendannede celler22,23.
De nuværende functionalized ledninger er baseret på anti-EpCAM antistoffer, som er udbredte epitelial markør for positiv markering af CTCs24. Som flere CTCs kan nedregulere epitelial markører som cytokeratins eller EpCAM25, ville tilføje antistoffer som HER2/nye øge chancen for CTC isolation. Flere antistof baseret berigelse strategier er blevet udviklet og gennemgået af Ferreira mfl. i 201626. En blanding af antistoffer immobiliseret på en wire kunne være en fremtidig forbedring af teknologi fører til isolering af et højere tal og flere undertyper af CTCs.
Det er obligatorisk for alle skridt involverer wire håndtering for at holde den funktionelle del af wiren neddykket i løsning for at opretholde dens funktionalitet. Vi anbefaler for at placere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; fx. trin 3.1. -3.3.) og opbevaring. For at undgå upassende farvning, anbefaler vi brug af frisk tilberedt Farvningsopløsningen i trin 1.2.1. og 1.2.2. Svagt farvede celler hæmmer celle tælle på ledningen og kan føre til undervurderingen af de tilknyttede celler.
Det er nødvendigt at undgå plugging Pasteur pipette med en gummihætte, når du indsætter wiren i Pasteur pipette til senere indlæsning af cellesuspension (trin 2.3.4.). Gummihætte bruges til at holde wiren på plads, så at den funktionelle del er beliggende inde i spidsen af Pasteur pipette. Hvis fælles landbrugspolitik er alt for fast tilknyttet den bageste del af Pasteur pipette, er indlæsning af cellesuspension ikke muligt. I dette tilfælde lette fælles landbrugspolitik, således at den luft, der er fordrevet af de indlæste cellesuspension kan forlade pipetten.
Bøje wiren er afgørende for dets orientering under cellen optælling i trin 3.2. og 3.3. Monter ledningerne ved hjælp af selvklæbende tape, sådan at de ikke-funktionelle ende af wiren kommer til at ligge til den ene side. Efter scanning af hele længden af den funktionelle del, kastes wiren 180°, så anden halvdelen af den funktionelle wire kan scannes. Dette trin er vigtigt for indledende forsøg at vurdere antallet af celler på wiren. Når antallet af celler for en bestemt cellelinje og proceduren er evalueret, proceduren kan gentages uden celle tælle (f.eks. kun kontrol for tilstedeværelse af celler eller udelade dette trin). Omhyggelig pipettering er afgørende for at undgå celletab når man skal reducere mængden af supernatanten taktfast 4.8. Sørg for pipettering sker gnidningsløst uden forårsager turbulens til pellet.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev finansieret af østrigske videnskab fond (FWF), projekt nr. I 1220-B19 (til PS) som en del af projektets ERA i translationel kræft forskning (TRANSCAN) “Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal Residual sygdom i Prostata Cancer (CTC-SCAN)”. Ph.d.-kandidat S.C. blev uddannet inden for rammen af ph.d.-programmet Molekylær medicin på det medicinske universitet i Graz. Forfatterne parlamentsarbejdet Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk bistand. Forfatterne vil gerne takke Georg Peinhaupt understøttelse af grafisk design.
Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
Standard PCR reagents | |||
6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |