Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet
Summary
Vi rapporterer en liten hårnål RNA (shRNA) og neste generasjons sekvensering-basert protokoll for å identifisere regulatorer av X-chromosome inaktivering i murine celle linje med firefly luciferase og hygromycin motstand gener del av methyl CpG bindende protein 2 ( MeCP2) Gen på inaktive X-kromosomet.
Abstract
Fremover genetisk skjermer bruker reporter gener inn i heterochromatin har blitt brukt å undersøke mekanismer epigenetic kontroll i modellen organismer. Teknologier inkludert kort hårnål RNAs (shRNAs) og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) har aktivert slike skjermer i diploide pattedyrceller. Beskriver her vi en storstilt shRNA skjerm for regulatorer av X-chromosome inaktivering (XCI), med et murint celle linje med firefly luciferase og hygromycin motstand gener banket i på C-terminus av methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2)-gen på den inaktive X-chromosome (Xi). Reaktivering av Konstruer i reporter cellen linje overdratt overlevelse fordel under hygromycin B valg, slik at vi kan skjermen en stor shRNA bibliotek og identifisere hårnåler som reaktivert reporteren ved å måle deres etter utvalg berikelse bruker neste generasjons sekvensering. De beriket hårnåler ble deretter individuelt validert ved å teste deres evne til å aktivere luciferase reporter på Xi.
Introduction
En mest vanlige former for arvelig mental svekkelse i kvinner, Retts syndrom, er forårsaket av heterozygote mutasjoner i MeCP2, en X-chromosome genet som koder et protein som er viktig for normal neuronal funksjon1. En potensiell tilnærming til behandling av denne lidelsen ville være reaktivering av vill-type MeCP2 allelet på Xi, som restaurering av MeCP2 uttrykk å reversere nevrologiske underskudd i en musemodell av denne sykdommen1, 2 , 4. men epigenetic silencing av en av de to X-kromosomer i kvinnelige celler er tett opprettholdt gjennom hele levetiden til en organisme3,4, og robust reaktivering av en Xi genet ville trolig kreve en større avbrudd i flere epigenetic regulatoriske veier.
For å identifisere faktorene på krevd for vedlikehold av MeCP2 stanse, vi utviklet en transgene musemodell bærer en MeCP2– luciferase – hygromycin motstand genet fusjon (MeCP2-LUC-HR) på en av de to X-kromosomer (X MeCP2-LUC-HRxMeCP2)5. Selv om MeCP2 uttrykt fra fusion konstruksjon viste seg for å være ustabil og resulterte i tap av funksjon, svært etterligne MeCP2 sletting i hemizygous menn (XMeCP2-LUC-HR/Y), uttrykk for reporter gener var lett synlig i et mønster samsvarer med uttrykket av endogene MeCP25. Vi deretter generert udødeliggjort fibroblast kloner med konstruere på enten inaktiv eller aktiv X-chromosome, og bekreftet at tidligere uttrykt wild type MeCP2 og ikke reporter Konstruer; motsatte var sant for sistnevnte. Når de utsettes for en DNA demethylating agent kjent å oppheve genet stanse, 5-azacytidine (5-AZA), celler med reporter på Xi (“reporter celler”) fikk aktivitet i en bioluminescens analysen, som indikerer at vår konstruere kan aktiveres og derfor brukes for genetisk screening.
Deretter utviklet vi en høy gjennomstrømming genetisk skjerm for regulatorer av MeCP2 stanse. Reporter celle linjen var først infisert med en retroviral biblioteket inneholder > 60 000 forskjellige shRNAs målretting > 25 000 gener i musen genomet5,6, og deretter utsatt for hygromycin B utvalg. Hårnål frekvensen ble sammenlignet før og etter valget prøver ved neste generasjons sekvensering, som reporter reaktivering overdratt vekst fordel under hygromycin B valg og resulterte i anriking av ansvarlig hårnåler. Bruker denne tilnærmingen, vi identifisert 30 gener innblandet i MeCP2 stanse, og senere bekreftet resultatene av transducing reporter cellene med personlige hårnåler og måle sin luciferase aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vår siste studie6, vi generert en murine celle linje med luciferase og hygromycin motstand gener del MeCP2 på Xi, og transduced det med et bibliotek med > 60.000 shRNAs målretting > 25 000 gener. Vi fant 30 gener som sammenleggbare tillagt overlevelse fordel under hygromycin B valg, tyder sin rolle i kontrollen av MeCP2 og X-chromosome stanse. Disse resultatene ble godkjent av transducing rapportert celle linje med personlige hårnåler og vurdere reaktivering av stille luci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ross Dickins av University of Melbourne for allernådigst skaffer shRNA biblioteket i skjermen. Dette arbeidet ble finansiert av Retts syndrom Research Trust (A.B.).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
