In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo
Summary
Segnaliamo un short hairpin RNA (shRNA) e sequenziamento basato su protocollo di ultima generazione per l’identificazione dei regolatori di inattivazione del cromosoma x in una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina fuse con il metil CpG binding protein 2 ( MeCP2) gene sul cromosoma di X inattivo.
Abstract
Avanti schermi genetici usando geni reporter inseriti l’eterocromatina sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi di controllo epigenetico in organismi modello. Tecnologie tra cui short hairpin RNA (shRNA) e cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) hanno permesso tali schermi in cellule di mammifero diploide. Qui descriviamo una schermata di shRNA su larga scala per regolatori di inattivazione del cromosoma x (XCI), utilizzando una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina bussò in al C-terminale di methyl CpG binding protein al 2 (MeCP2) gene sul cromosoma x inattivo (Xi). Riattivazione del costrutto nella linea cellulare reporter conferiti vantaggio di sopravvivenza sotto selezione igromicina B, consentendoci di schermo una biblioteca grande shRNA e identificare forcine che riattivato il reporter misurando il loro utilizzo di arricchimento post-selezione sequenziamento di nuova generazione. Le forcine arricchite poi sono state convalidate individualmente verificando la loro capacità di attivare il reporter di luciferase su Xi.
Introduction
Uno le forme più comuni di danno mentale ereditario nelle femmine, la sindrome di Rett, è causato da mutazioni eterozigoti in MeCP2, un gene del cromosoma x che codifica per una proteina essenziale per la normale funzione di un neurone1. Un potenziale approccio per trattare questo disordine sarebbe riattivazione del selvaggio-tipo allele di MeCP2 su Xi, come ripristino dell’espressione di MeCP2 è stata indicata per invertire i deficit neurologici in un modello murino di questa malattia1, 2 , 4. Tuttavia, silenziamento epigenetico di uno dei due cromosomi in cellule femminili X sia strettamente mantenuto durante tutta la durata della vita di un organismo3,4, e robusta riattivazione di un gene di Xi probabilmente richiederebbe una maggiore rottura in più vie di regolazione epigenetiche.
Per identificare i fattori necessari per la manutenzione del silenziamento di MeCP2 , abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico che trasportano una fusione del gene MeCP2– luciferasi – igromicina resistenza (MeCP2-LUC-HR) su uno dei due cromosomi X (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Sebbene la MeCP2 espresso dal costrutto fusione ha dimostrato di essere instabile ed ha provocato una perdita di funzione, fenotipico che imita l’eliminazione MeCP2 nei maschi emizigoti (X/y diMeCP2-LUC-HR), l’espressione dei geni reporter era prontamente rilevabile in un modello costante con l’espressione endogena di MeCP25. Abbiamo quindi generato cloni dei fibroblasti immortalati con il costrutto sul cromosoma x attivo o inattivo e ha confermato che l’ex espresso wild type MeCP2 e non la costruzione del reporter; l’inverso è vero per quest’ultimo. Quando esposto ad un DNA demethylating agente conosciuto per abrogare il silenziamento genico, 5-azacitidina (5-AZA), cellule con il reporter su Xi (“cellule di reporter”) guadagnato attività in un’analisi di bioluminescenza, che indica che il nostro costrutto potrebbe essere riattivato e quindi utilizzato per lo screening genetico.
Abbiamo sviluppato successivamente una schermata genetica ad alta produttività per regolatori del silenziamento di MeCP2 . La linea cellulare reporter in primo luogo è stata infettata con una libreria retrovirale contenenti > 60.000 diversi shRNA targeting > 25.000 geni in tutto il genoma del mouse5,6e quindi sottoposti a selezione igromicina B. Frequenza tornante è stata confrontata in pre- e post-selezione campioni mediante sequenziamento di nuova generazione, come reporter riattivazione conferiti vantaggio di crescita sotto igromicina B selezione e arricchimento di forcine responsabile ha provocato. Utilizzando questo approccio, abbiamo identificato 30 geni implicati in MeCP2 silenziamento e successivamente ha confermato i risultati transducing le cellule reporter con forcine individuali e misurando la loro attività luciferasica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel nostro recente studio6, abbiamo generato una linea cellulare murina con luciferasi e geni di resistenza igromicina fusa per MeCP2 su Xi ed esso trasdotte con una libreria di > 60.000 shRNA targeting > 25.000 geni. Abbiamo trovato 30 geni cui vantaggio di sopravvivenza hanno conferito colpo sotto selezione igromicina B, suggerendo loro ruolo nel controllo di MeCP2 e silenziamento del x-cromosoma. Questi risultati sono stati convalidati trasdurre la linea cellulare segnalati co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie Ross Dickins dell’Università di Melbourne per fornire gentilmente la libreria di shRNA utilizzata nella schermata. Questo lavoro è stato finanziato da Rett sindrome Research Trust (A.B.).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
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