QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.
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Artigo de método
Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib). Dados recentes sugerem que as moléculas de Qa-1 desempenham papéis importantes em Agrimensura células para integridade estrutural e funcional, induzindo o Regulamento imune e limitando a resposta imune a infecções virais. Além disso, funcional aumento de CD8 Qa-1-restrito+ T células através do epítopo imunização tem mostrado efeitos terapêuticos em vários modelos animais doença auto-imune, por exemplo, experimental encefalomielite alérgica, artrite induzida por colágeno e diabetes não-obesos. Portanto, há uma necessidade urgente de um método que pode eficientemente e rapidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionais em uma proteína. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza o CD8 Qa-1-restrito+ célula T linhas específicas para uma biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas para determinar os resumos de Qa-1 em uma proteína. Esta biblioteca OLP contém 15-mer sobreposição peptídeos que cobrem todo o comprimento de uma proteína, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos. Usando este protocolo, identificamos recentemente um epítopo de Qa-1 9-mer em glicoproteína oligodendrocyte de mielina (MOG). Este recém mapeada epítopo MOG Qa-1 foi mostrado para induzir CD8 epítopo específico, Qa-1-restrito+ T células desse regulamento imune reforçado de mielina específicos. Portanto, o presente protocolo é útil para futura investigação de novos objectivos e funções de CD8 Qa-1-restrito+ T células.
Introdução
QA-1 pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib) em camundongos. Seu homólogo humano é HLA-E. Provas anteriores tem demonstrou que as moléculas de Qa-1 tem importantes funções biológicas. Em primeiro lugar, Qa-1 moléculas desempenham um papel importante no levantamento de células para a integridade estrutural e funcional. Neste aspecto, Qa-1 moléculas evoluíram diversas estratégias para monitorar a função normal de uma célula. Uma tal estratégia permite Qa-1 moléculas para formar complexos com um peptídeo líder transformados (epítopo), ou seja, o Qa-1 determinante modificador (Qdm) é processado a partir de moléculas....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com um protocolo de uso aprovado pelo Comité de uso, a Universidade do Texas em El Paso e a Universidade de Loma Linda e cuidado Animal e institucional Cuidado Animal.
1. geração de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína
- Projete uma biblioteca da OLP na qual todos os peptídeos são mer-15 de comprimento, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos.
Nota: No estudo MOG OLP, sequência do precursor MOG [Mus musculus] foi obtida em banco de dados da proteína NCBI, seguindo este link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Utilizou-se ....
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Resultados
Projeto de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína
Começando no N-terminal de uma proteína, cada peptídeo é 15 aminoácidos (15-mer). Portanto, o primeiro peptídeo abrange a posição 1 para a posição 15. N-terminal do peptide segundo se sobrepõe com o C-terminal do peptide primeiro por 11 aminoácidos. Portanto, o segundo peptídeo abrange a posição 5, a posição 19. Desenha o resto dos peptides à extremidade do C-.......
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Discussão
Aqui, descrevemos um protocolo para a análise de resumos de Qa-1 em uma proteína. Em relação ao presente protocolo, várias outras estratégias também foram relatadas anteriormente. Em primeiro lugar, alogênico CD8+ linhas de células T e clones foram utilizados para a identificação do Qdm1. Em segundo lugar, um putativo Qa-1-motivo da análise de Qdm foi usado para a identificação da HSP60p216-224 e um epítopo TCRBV8.19,18. Terceir.......
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Divulgações
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a Penelope Garcia para a assistência técnica e preparação deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa inovação Grant (RIG) do departamento de medicina da Universidade de Loma Linda (681205-2967) e uma concessão piloto da sociedade nacional de esclerose múltipla (PP1685) de XT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| A proteína a ser analisada | N/A | N/A | A sequência da proteína pode ser obtida a partir do NCBI |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 O SIGMA | DMSO deve ser estéril e a cultura de células deve ser testada. |
| Camundongos Kb-/-Db-/- | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | Usamos camundongos knockout Taconic H2-KbH2-Db doube knockout (Cat#: 4215-F e 4215-M) que, no entanto, não estão mais disponíveis. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoetanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Aminoácidos Não Essenciais | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Kit de Isolamento Positivo | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Solução Balanceada de Fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: Pipeta de transferência de 20012027 | |
| Globe Scientific | Mfg#: 137238 | ||
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| Placas de cultura de tecidos de 48 poços | Gato da USA Scientific | #: CC7682-7548 | |
| Placas de múltiplos poços tratadas com Corning Costar TC, 96 poços, fundo em forma de V | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Placa PP Sigma | |
| de 1 ml de 06 poços de profundidade, estéril | Item científico dos EUA | #: 1896-1110 | |
| Gato murino recombinante IL-2 | PeproTech | #: 212-12 | |
| Gato murino recombinante IL-7 | PeproTech | #L: 217-17 | |
| Captura anti-IFN-&gama; anticorpo | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| placa ELISPOT | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R. Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 vetor lentiviral | GeneCopoeia | Produto#: Mm02955 | |
| Detecção anti-IFN-&gama; anticorpo | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| Substrato AEC | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| Analisador ImmunoSpot | ImmunoSpot | Qualquer analisador immunoSpot deve funcionar para esta finalidade. |
Referências
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H.
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Reimpressões e permissões
