Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Summary

Det här protokollet beskriver en teknik för observation av realtid grönt fluorescerande Protein (GFP) taggade glukos Transporter 4 (GLUT4) protein människohandel på insulin stimulans och karakterisering av CCR5 biologiska roll i det insulin – GLUT4 signalering utbildningsavsnitt med Deconvolution mikroskopi.

Abstract

Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris som kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus i det centrala nervsystemet (CNS) är ett kontrollcenter för energi och insulin signal svar förordning. Kronisk inflammation i perifera vävnader och obalanser i vissa chemokiner (t.ex. CCL5, TNFα och IL-6) bidra till diabetes och fetma. De funktionella mekanismerna ansluta chemokiner och hypotalamus insulin signal förordning fortfarande är dock fortfarande oklart.

In vitro primära neuron kultur modeller är bekväm och enkel modeller som kan användas för att undersöka insulin signal förordning i hypotalamus nervceller. I denna studie introducerade vi främmande GLUT4 protein konjugerat med GFP (GFP-GLUT4) till primära hypotalamus nervceller att spåra GLUT4 membran translokation vid insulin stimulering. Time-lapse bilder för GFP-GLUT4 protein människohandel spelades in av deconvolution mikroskopi, som får användare att generera höghastighetståg, högupplösta bilder utan att skada nervceller betydligt samtidigt genomför experimentet. Bidraget av CCR5 i insulin regleras GLUT4 translokation observerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller, som var isolerade och odlade från CCR5 knockoutmöss. Våra resultat visade att GLUT4 membran translokation effektivitet reducerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller insulin stimulation.

Introduction

Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris. T2DM kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus är Kontrollcenter som reglerar kroppens energi homeostas, aptit och dygnsrytm. Viktigast av allt, förmedlar hypotalamus också insulin signal lyhördhet för att reglera systemisk metabolism^1,2,3,4,5. Störa hypotalamus insulin signalering utbildningsavsnitt skulle kunna framkalla insulin resistens^6,7. Hypothalamus samordnar cellulär energistatus och utsöndringen av hormoner såsom insulin och adipokines (e.g., leptin) från perifera vävnader, att reglera systemisk glukosmetabolism, insulin lyhördhet och födointag. Insulin bindande till insulin receptor aktiveras insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som sedan aktivera insulin nedströms signalmolekyler, såsom PI3K (fosfatidylinositol 3-Kinas) och AKT (proteinkinas B (PKB/AKT)), att framkalla GLUT4 membranet translokation. Nervceller är inte det stora målet för glukosupptag i svar till insulin; dock har betydande nivåer av GLUT4 uttryck identifierats i regionen hypotalamus arcuate nucleus (ARC). Regleringen av GLUT4 i hypotalamus nervceller kan därför spela en viktig roll i insulin signalering i hjärnan-perifera axeln.

Många studier har föreslagit att kronisk inflammation och inflammatoriska chemokiner i hypotalamus också spela en viktig roll i utvecklingen av diabetes och fetma, och hämning av hypotalamus inflammation kan återföra kost-inducerad insulinresistens ^{8 , 9 , 10}. övrigt, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, även känd som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) och dess receptor CCR5 nivåer korrelerar också med utveckling av T2DM^11,12. CCL5 och CCR5 roller i insulin funktion och glukos metabolism förblir oklart. En studie rapporterade att CCR5-brist skyddade möss från fetma-inducerad inflammation, makrofag rekrytering och insulin resistens¹¹; Däremot rapporterade en annan studie att CCR5-brist försämrar systemisk glukostolerans, liksom fettceller och muskel insulin signalering¹². CCL5 återfinns att öka glukosupptag i T-celler och minska födointaget genom sitt agerande på hypotalamus^13,14, dock båda verkningsmekanismen och receptorerna som är inblandade är ännu identifieras.

Det är svårt att studera cellulära mekanismerna bakom effekten av perifer vävnadsinflammation på insulin funktion i hypotalamus nervceller. Detta beror på cellulära heterogenitet och neuron krets feedback förordningar. Av denna anledning ger en kultur i vitro cell modell en ren modell för att undersöka effekterna av chemokine på hypotalamus insulin signal förordning. Det finns många etablerade förevigade hypotalamus neuronala cellinjer för forskningsändamål, dessa cellinjer uttryckt olika markörer, och representerar därför olika typer av hypotalamus nervceller¹⁵. Även om primära hypotalamus kulturer kan vara svårt att upprätthålla, de kan ge den mest realistiska Svaren av hypotalamus nervceller vid insulin stimulering, och kan också undvika potential okända effekter som kommer in i spela vid underhåll celler långsiktig odlingsmedium med konstgjorda tillväxtfaktorer.

Häri, vi använda primära hypotalamus nervceller från både C57BL/6 vildtyp (WT) mus och CCR5 knockoutmus (CCR5^{– / –}) och transfect båda typer av celler med GFP-GLUT4 konstruktion. För att undersöka CCR5 bidrag till insulin medierad GLUT4 membran människohandel, behandlades GFP-GLUT4 transfekterade nervceller med insulin eller rekombinant CCL5. Vi präglar sedan rörelsen av GFP-GLUT4 på plasmamembranet i primära hypotalamus nervceller med Deconvolution mikroskopi.

Protocol

Alla protokoll och metoder används i animaliska ämnen har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC) Taipei Medical University (protokoll nummer: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397) 1. primära Neuron kultur Förberedelser innan kultur Coat kultur rätter med poly-D-lysin (tabell 1) en dag före kultur. För en 6-väl skål, tillsätt 1,5 mL poly-D-lysin (0,05 mg/mL) i varje brunn. För live-imaging, kultur celler på ett 12 x 12 mm täckglas i en standard belagda 6-bra platta. Ta bort/återvinna den poly-D-lysin och diska två gånger med 2 mL ddH2O. Förbereda de kirurgiska verktyg: ett par mikro-dissekera saxen, böjda-tipped pincett och standard rak-tipped pincett. Sterilisera kirurgiska verktyg och hålla dem i 75% etanol under operation. Fyll 10 cm petriskålar med 20 mL tvätta medium (tabell 1) och hålla på is. Fyll ett 15 mL provrör med 15 mL tvätta medium och hålla röret på is. Hjärnans vävnad isolering från olika hjärnregioner Offra 16-19 dag gammal dräktiga honmöss med standard dödshjälp protokoll genom att placera möss i en icke ventilerade bur och sedan berusande med CO2. E15.5 ~ E16.5 embryon rekommenderas för hypotalamus neuronala kultur och E16.5 ~ E17.5 är mer lämpade för hippocampus och kortikala neuronala kultur. Sterilisera den plattform, dissekera mikroskopet och kirurgi verktyg med 75% etanol att undvika kontaminering. Skär runt navelsträngen området (mörka röda området, figur 1A, 1B streckad linje) för att isolera ungarna lätt utan att skada dem (figur 1 c, 1 D). Ta bort huvudet portion av varje valp med en sax (figur 1E, F) och sedan skydda huvudet portion in med spetsig raka pincetten för regionen ögat (figur 1 g). Använd en annan spetsig böjd pincett för att ta bort den yttre huden och skalle från två sidor och lossnar dem från den främre i dorsal riktning (figur 1 H, svart pilen pekar i riktning). Hjärnan bör isoleras utan skador (figur 1I).Obs: Det är viktigt att upprätthålla integriteten i hjärnan för att säkerställa noggrannheten när isolera olika regioner av hjärnan. Hålla isolerade hjärnor i en ren petriskål med iskall tvätta medium för följande steg. Vänd hjärnan och hålla den ventral sidan. Hypothalamus är en rund struktur i mitten av hjärnan (figur 1J, pilen pekar på hypotalamus regionen). Isolera hypotalamus vävnaden med spetsig böjd pincett. Ta bort meningerna (som har en gulröd färg) noggrant.Varning: Fullständig borttagning av hjärnhinnorna är ett viktigt steg för att undvika fibroblast kontaminering. Håll den luktsinnet LOB med vassa pincetten och lossnar tunna hjärnhinnan som omger hela hjärnan med böjda tången (figur 1 K, L). Hippocampus är en banan-liknande form som är inbäddad i den nedre delen av hjärnbarken. Vänd på undersidan av cortex och separera hippocampus från cortex genom att dra det åt sidan med böjda pincetten (bild 1 MN, och O). Glöm inte att ta bort alla återstående hjärnhinnor som omger hjärnvävnaden. När alla regioner av hjärnan har isolerats, hacka dessa vävnader i 15 mL rör som innehåller iskall tvätta medium med hjälp av tången (steg 1.1.5).Obs: Hjärnans vävnader kan hållas i det iskalla tvätta mediet för 2-3 h. Vävnaden matsmältningen, plätering och kultur Skölj vävnaderna genom att vända den vävnad innehållande 15 mL rör 2 – 3 gånger och sedan hålla röret rakt så att vävnaderna att bosätta sig på (1-3 min). Ta bort det övre mediet använder glaset Pasteur-pipett bifogas ett vakuumsystem. För att tvätta vävnaden, tillsätt 15 mL ice cold wash medium och Invertera röret 2 – 3 gånger. Tvätta stegen 3 gånger innan nästa steg.Varning: Var försiktig med vävnader på botten när du tar bort övre mediet använder ett vakuumsystem. Efter den sista tvättningen, ta bort tvätta mediet med hjälp av 1 mL pipett. Inkubera vävnader med Papain-Trypsin matsmältningen buffert (tabell 1) i 37 ° C vattenbad för 7-14 min. skaka rören var två min så alla vävnader utsätts ordentligt för matsmältningen bufferten.Obs: Inkubationstiden och volymen av matsmältningen buffert kan justeras baserat på vävnad storleken. För hypotalamus vävnad som samlats in från 6-8 ungar, rekommenderas 300 µL Papain-Trypsin buffert och 7 min inkubering koktiden. Mer vävnad kommer att kräva mer matsmältningen buffert. Neutralisera den enzymaktivitet genom att lägga till 1 volymdel fetalt bovint serum. Skaka provröret 3 – 5 gånger i rumstemperatur. Håll röret på rack och vänta 1-2 min så att vävnaderna att bosätta sig; ta bort supernatanten noggrant med en 1 mL pipett. Tillsätt 6 mL plätering medium (tabell 1) in i provröret och Pipettera vävnaden up-and-down 50 gånger med 5 mL pipett försiktigt (för en 6-well platta, 1,5 mL plätering medium per brunn rekommenderas). De flesta celler kommer att separera in enstaka celler efter upprepad pipettering.Obs: Försök att undvika bildandet av bubblor under utförande av detta steg. De flesta laboratorier använder flammade glas betesmark pipetter för att sära på vävnaden. En 5 mL pipett med en smal spets kan vara ett bra alternativ för det här steget. Hålla en tub på racket och vänta 1-2 min att tillåta chunky, un-dissocierade vävnader att slå sig ner. Ta den övre fasen som innehåller differentierade celler till en ny tub och späd med plätering medium (5 x volym plätering medium per 1 x volym dissocierade celler. Till exempel, tillsätt 5 mL plätering medium för 1 mL separerade celler). Beräkna cell densiteten med hjälp av en hemocytometer och utsäde det nödvändiga antalet celler i kultur plattan belagd med poly-D-lysin som i steg 1.1.1. Vi rekommenderar 2-4 x 105 celler per brunn för en 6 väl maträtt/35 mm maträtt rekommenderades för neuron studier avbildning. Högre densitet skulle behövas för protein insamling och analys.Obs: Lägg inte för mycket plätering medium, 1-1,5 mL plätering medium i en 6-väl maträtt är tillräcklig för fastsättning. En överdriven mängd medium kommer att förlänga den tid som krävs för korrekt cell fastsättning. Vänta 2-3 h och kontrollera de seedade nervcellerna under mikroskopet. Nervceller börjar växa neurit när de fäster ordentligt. Ta bort plätering medium och tillsätt 2 mL värmde tvätta medium (37 ° C) i skålen att tvätta bort plätering medium. Upprepa detta steg två gånger. Tillsätt 2 mL komplett odlingsmedium (tabell 1) i varje brunn i 6-väl skålen. Ändra hälften av medlet efter 3-4 dagar. Förbereda det komplett mediet nymalen varje gång. Nervceller som odlade från annan mus av hjärnan har olika morfologi och egenskaper (figur 2). 2. transfection av Plasmid DNA in i primära Neuron med Liposom System FÖRSIKTIGHET: För neuron transfection rekommenderas en endotoxinfria plasmid DNA rening kit (Material tabell) för DNA beredning. Ytterligare etanol nederbörd kan ta bort överflödig vätska och förbättrar DNA-koncentration. Liposom-baserad DNA transfection i primära nervceller.Obs: Transfection tiden beror på mognad status krävs i experiment. Hypotalamus nervceller var transfekterade på DIV 7-10 (DIV, dagar in vitro). DNA: Liposom blandningsförberedelsen: Späd GFP-GLUT4 plasmid DNA16 (2 µg) i en mikrocentrifug rör innehållande 300 µL låga serum odlingsmedium. Förbereda en annan mikrocentrifug rör med 2 µL Liposom i 300 µL låga serum odlingsmedium och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Kombinera innehållet i båda rören och inkubera i 20-30 min i rumstemperatur. Ta bort neuron odlingssubstratet från kultur skålen. Lägga till 600 µL DNA-Liposom blandning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 4-6 h. Efter 4-6 h, ta bort DNA-Liposom blandningen och tillsätt 2 mL odlingsmedium. Fluorescerande signaler, till exempel GFP ensam och GLUT4 protein konjugerat med GFP tagg (figur 3 och figur 4), kan observeras efter 18-72 h. 3. levande bildinspelning Förbereda celler för Live Imaging Kultur WT och CCR5- / – hypotalamus neuron celler som uttrycker grön fluorescens protein märkt glukostransportör 4 (GFP-GLUT4) på #1.5 (eller 0.17 mm tjocklek) täckglas som varit före belagda med poly-D-lysin i steg 1.1.1 i 6-brunnen plattan. Försiktigt bort coverslips med nervceller med pincett och placera den på glasskivor med försiktighet. Ta bort överflödig medium/vätska med delikat uppgift våtservetter. Vik våtservetter två gånger, och försiktigt placera dem ovanpå täckglaset. Tryck försiktigt ned våtservetter utan att flytta på täckglas.Varning: Tryck inte på täckglas mot glasskiva kraftfullt. Syftet med detta steg är att säkerställa att den täckglas inte flytta/drift under Bild Förvärvandet orsakas av stark kraft. Placera coverslips och diabilder på deconvolution Mikroskop scenen, med täckglas vänd nedåt och säkrade ordentligt. Detta steg är att se till att positionen bilden förblir konstant så att användare kan spåra samma uppsättning målceller senare. Iaktta WT och CCR5- / – hypotalamus neuron celler med en 60 x / 1,42 NA olja nedsänkning objektiv. Behandla de markerade cellen proverna med CCL5 (10 ng/mL) eller insulin (10 E/mL) för en min. Tillsätt 1,5 µL utspädda insulin på kanten av täckglaset. Visualisera och spela in de markerade cellen proverna omedelbart. Program den videoinspelning programvaran för att spela in i 30 min. Deconvolution mikroskopi och analysObs: Denna del av protokollet kräver användning av en avfaltning mikroskopet och specialiserad programvara för analys. Slå på strömmen av bildgivande systemet, tillåta Mikroskop scenen för att initiera korrekt, och slå sedan på den LED-ljuskällan. Lägg till nedsänkning olja (brytningsindex 1.520 för levande prover vid 37 ° C) på en 60 x 1,42 NA objektiv. Placera provet bilden på mikroskopet med den täckglas vänd mot objektivet och säkra bilden ordentligt. Använd ljusa fält eller fluorescens belysning för att identifiera målceller. Justera fokus tills målceller tydligt kan observeras. Flytta inte objektivet utanför området täckglas för att undvika onödiga repor. Identifiera grön fluorescens protein konjugerat glukos Transporter 4 (GFP-GLUT4) av GFP signalen. Identifiera önskad målceller för bild förvärv. Valda målpositionen cell kan memoreras för framtida referens (figur 4). Setup rätt experimentella parametrar (inklusive PIXELet numrerar, excitation våglängd, överföring procentandel, exponeringstid, stack tjocklek, tidsintervall och total imaging tid) på varje målcellen. För detta experiment fastställdes bild pixel antalet till 512 x 512 (det kan ställas in på 1 024 x 1 024 för högre upplösning) för god Jordbrukarsed signaler. Exponeringstiden var inställd mellan 0,025 till 0,05 s för varje 5 min. mindre lateral x, y och z justeringar kan styras av rekommenderade programvara (material tabell). Ange parametern exponering till cirka 2.000 till 3.000 räknas att uppnå maximal pixel intensitet. För att minimera fluorescens fotoblekning, minska andelen ljus magnetiseringsöverföringen så mycket som möjligt medan hålla exponeringen tid mindre än 1 s. Upprepa dessa steg för varje ytterligare fluorescens kanal och varje enskilt intresseområde. Ange den övre och undre gränsen för Z-stacken på varje målcellen. Detta kan uppnås genom att flytta Mikroskop scenen tills toppen och botten av målcellen är båda något ur fokus. Användare kan justera bildupplösningen i z-axeln genom att ställa in antalet bilder mellan den övre och undre gräns (vilket kan göras genom att ställa in avståndet mellan varje bild). Travar av bilder var deconvolved och senare analyseras med hjälp av respektive programvaran – hastighet från PerkinElmer i detta fall.

Representative Results

Hypotalamus nervceller odlade från möss identifierades ytterligare genom immunfärgning med hypotalamus specifikt protein – pro-opiomelanocortin (POMC) antikropp och neuronala markör – mikrotubulära-associerade protein 2 (MAP2) (figur 2A). Vi bekräftade den primära odlade hypotalamus nervceller uttryckt hypotalamus protein POMC. Uttrycket av CCR5 receptor och CCL5 i hypotalamus nervceller identifierades med specifika antikroppar och samtidig märkt med POMC antikropp (figur 2A, 2B). Efter 3 dagars odling, nervceller var transfekterade med GFP DNA (figur 3) eller GFP konjugerat GLUT4 (figur 4). GFP uttryck kan vanligtvis hittas över cellen utan ett visst mönster (figur 3) men den GLUT4-GFP kommer att uttrycka som en punktuell-liknande struktur i cytosolen (figur 4). Transfection kit används i denna studie är inte den effektivaste metoden för neuron transfection; Det är dock en mindre stränga metod för bättre cellöverlevnad efter transfection, vilket bidrar till bättre live-cell imaging/inspelning senare. Bilder av GFP-GLUT4 uttrycker nervceller togs innan time-lapse filmer (figur 4A-B, kompletterande video 1, 2) insulin stimulering eller CCL5 stimulering (figur 4 c, kompletterande video 3). Signalerar av god Jordbrukarsed och GFP-GLUT4 är tydliga och starka i nervceller. Hypotalamus nervceller med GLUT4-GFP transfection behandlades ytterligare med insulin (40 U) att karakterisera GFP-GLUT4 människohandel. Klandervärt videor GLUT4-GFP rörlighet vid insulin stimulering i både WT och CCR5- / – hypotalamus nervceller visas som Video 1 och Video 2, respektive. Figur 1: isolering av vävnader från olika regioner av hjärnan som musen på embryostadiet (dag 16,5). (A-D) De olika stegen i separation av valpar från moderkakan. (E, F) Dissektion av ett pup huvud från kroppen. (G-jag) De olika stegen i isolering av hela hjärnan från skallen. Svart pilen pekar i riktningen att dras när du tar bort skallen med pincett. (J) isolering av hypotalamus. Den svarta pilen pekar på hypotalamus regionen mellan tången. (K-L) Isolering av cortex av mus hjärnan. Svart asterisken indikerar kortikala regionen mus hjärnan och vita pilen pekar till avskiljandet av cortex från hela hjärnan. (M-O) Avskiljandet av hippocampus portion från cortex. Den övre vita pilen markerar Hippocampus vävnaden och den nedersta vita pilen markerar kortikal vävnad. Skala barer = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: karakterisering av hypotalamus neuronala markör – POMC och samtidig uttryck för CCL5 och CCR5. (A) primär odlade hypotalamus nervceller var märkt med hypotalamus neuronala markör – POMC (röd), samtidig uttrycket av CCR5 (grön) och neuron markör MAP2 (grå). (B), CCL5 (grön)-uttryck i POMC (röd) positiva hypotalamus nervceller (anpassad från kompletterande data referens17). Här, märkt DAPI kärnan med blå färg. Skala barer = 50 µm i (A) och (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: GFP proteinuttryck i mus primära nervceller. GFP plasmid DNA transfekterade till primära odlade nervceller efter 4 dagar kultur (DIV4) med Liposom och uttryckt för en annan 3 dagar (DIV7). (A-B) GFP uttrycks i både neurit och soma. (C-D) Nervceller med mock transfection; DAPI märkt kärnan i (B, D). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. Figur 4: ögonblicksbilder av GFP-GLUT4 i hypotalamus nervceller. (A, C) GFP-GLUT4 protein uttryckt i vildtyp (WT) hypotalamus nervceller och (B) CCR5- / – hypotalamus nervceller. Nervceller stimuleras med insulin (A, B) eller CCL5 (C). Pilarna pekar på den GFP-GLUT4 punktuell i neurit innan (-) och efter (+) insulin eller CCL5 stimulering och asterisker peka på den ytan GLUT4-GFP innan (-) och efter (+) CCL5 stimulering i (C),. (Figur anpassad från referens17). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 5 x Borade buffert Företaget Katalognummer Volym Borsyra Sigma-Aldrich B6768 1.55 g Borax Sigma-Aldrich 71997 2.375 g ddH2O 100 mL Filtrerad, hålla vid 4 ° C 20 x Poly-D-lysin lager Företaget Katalognummer Volym Poly-D-lysin Sigma-Aldrich P6407 100 mg ddH2O 100 mL Filtrerad, hålla på-20 ° C 1 x Poly-D-lysin Volym 20 x Poly-D-lysin 5 mL 5 x Borade buffert 20 mL ddH2O 75 mL Totalt 100 mL Hålla vid 4 ° C Tvätta Medium Företaget Katalognummer Volym DMEM-hög glukos Gibco 12800-017 495 mL Antibiotika-Antimyotic Gibco 15240-062 5 mL Totalt 500 mL Hålla vid 4° C Papain-Trypsin matsmältningen buffert: Företaget Katalognummer Volym/slutlig koncentration Papain (10 mg/mL) Sigma-Aldrich P4762 200 µL (2 mg/mL) Trypsin-EDTA (0,25%) Gibco 25200-072 200 ΜL (0,05%) Tvätta Medium 600 ΜL Totalt 1000 ΜL Hålla vid-20 ° C Plätering medium: Företaget Katalognummer Volym Neurobasal medium Gibco 21103-049 176 mL Fetalt bovint Serum Gibco 10437-028 20 mL L-glutamat (200 mM) Gibco 25030 2 mL Antibiotika-Antimyotic Gibco 15240-062 2 mL Totalt 200 mL Hålla vid 4 ° C Komplett odlingsmedium Företaget Katalognummer Volym Neurobasal medium Gibco 21103-049 95 mL N2 tillägg (100 x) Gibco 17502-048 1 mL B27 tillägg (50 x) Gibco 17504-04 2 mL L-glutamat (200 mM) Gibco 25030 1 mL Antibiotika-Antimyotic Gibco 15240-062 1 mL Totalt 100 mL Nylagade Tabell 1: Matsmältningen buffert och media sammansättning används i denna studie. Kompletterande Video 1: Insulin stimulerat GFP-GLUT4 rörelse i WT hypotalamus nervceller. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Kompletterande Video 2: Insulin stimulerat GFP-GLUT4 rörelse i CCR5- / – hypotalamus nervceller. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Kompletterande Video 3: CCL5 stimuleras GFP-GLUT4 rörelse i WT hypotalamus nervceller (Video anpassad från referens17). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Möjlighet att övervaka levande celler, vid CCL5 eller insulin stimulering, är kritiskt viktigt för att studera snabba effekten av CCL5 eller insulin på GLUT4 rörelse. I själva verket tillåter det oss att visualisera den signifikanta skillnaden mellan WT och CCR5^{– / –} hypotalamus nervceller vid insulin stimulering. Vi har utfört ytan märkning av endogena GLUT4 protein i WT och CCR5^{– / –} hypotalamus nervceller vid olika tidpunkter efter insulin stimulering¹⁷. Märkning av cell ytproteiner kräver hög-specificitet antikroppar med låg bakgrund. Dessutom kan ytan fluorescens kvantifiering också vara utmanande och tidskrävande. Således, time-lapse recording tillåter oss att vara säker på att effekten av CCL5 eller insulin är en sann fysiologisk förändring baserat på experimentella förhållanden, i stället för en statistisk variation. Tillsammans med surface märkning av endogena GLUT4, erbjuder vi starka bevis och experiment för att visa hur CCL5 och CCR5 delta i GLUT4 translokation och insulin signalering.

I modern cellbiologi och molekylärbiologi studier kräver många experiment utnyttjandet av fluorescensmikroskopi. Denna teknik tillåter forskare att visualisera rumsliga förhållandet mellan proteiner och/eller cellulära organeller, förutom rörelseriktning och hastighet, stimulerande effekter, morfologiska förändringar och protein människohandel. Denna teknik har dock fortfarande sin begränsning: när fluorophores är upphetsad, signaler som sänds från målproteinet (eller område) kan bli överväldigad av bakgrunden fluorescens. Som ett resultat, kan fluorescens bilder suddiga med förväntade signaler begravd djupt i bakgrunden signaler. Detta fenomen är särskilt tydligt för observationen av membran-bundna proteiner.

Total inre reflektion Fluorescence mikroskopi (TIRFM) utvecklades för att övervinna denna svårighet. Det tillåter forskare att visualisera excitation av valda yta-bundna fluorophores utan att påverka den bakgrunden fluorophores. Det tillåter forskare att selektivt karakteriserar funktioner och händelser på en mycket tunn yta region som ett plasmamembran. Deconvolution mikroskopi är ett arbetsintensivt bildbehandling teknik som möjliggörs med hjälp av tekniska framsteg under de senaste åren. Det har ofta använts för att förbättra digital fluorescens bildupplösning. Som nämnts tidigare, när fluorophores exciteras av någon typ av belysning (såsom laser eller LED), avger alla fluorophores ljus signaler oavsett om de är i fokus eller inte, så bilden visas alltid suddiga. Detta oskärpa som orsakas av ett fenomen som kallas ”punkt sprida funktion” (PSF), eftersom ljus kommer från en liten fluorescerande källa (ljuspunkt) kommer att sprida ut ytterligare och bli ur fokus (oskärpa). I princip denna händelse kommer att producera en timglas-liknande formade fluorescerande signal och en fluorescens bild kan bestå av många sådana ljussignaler. Deconvolution processen kan omtilldela alla fluorescens signaler till dess ursprungliga ljusa spot form, och eliminera de flesta av out-of-fokus ljuset att förbättra bildens kontrast.

Under de senaste åren har deconvolution algoritmer genererade bilder med jämförbar upplösning som confocal Mikroskop. Dessutom i jämförelse med TIRFM, som förhindrar out-of-fokus oskärpa från att bli upptäckt av en begränsad excitation region, wide-fältet mikroskopi låter alla ljus signalerar att upptäckas och tilldelar dem tillbaka till deras källa genom deconvolution processen. Därför i praktiken blivit deconvolution mikroskopi inte bara en mer effektiv bild förvärvsmetod, men också en mer kostnadseffektiv metod jämfört med Frida mikroskopi.

Materials

DeltaVision deconvolution microscope	Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)		equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images
SoftWorX application software	Applied Precision Inc.		used to control microscope and camera
VoloCITY software	PerkinElmer		used to analyze the images
Insulin	Actrapid, Denmark
Liposome	Invitrogen	11668019	Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection
GFP control plasmid DNA			provided by Professor Samuel Cushman
GFP-GLUT4 plasmid DNA			provided by Professor Samuel Cushman
Anti-mouse Alex-488	Invitrogen	#A-11001	Secondary anitbody
Anti-rabbit IgG -Alex-568	Invitrogen	#A-11036	Secondary anitbody
CCL5/RANTES	R&D Systems	478-MR-025	10ng/ml
Kimwipes	Kimberly-Clark	#FL42572A	0.17mm thickness
12 mm Microscope coverglass	Deckglaser	#41001112	used for immmunstaining study
micro-dissecting scissors	Klappenecker		Surgical tool
curved-tipped forceps	Ideal-tek		Surgical tool
standard straight-tipped forceps	Ideal-tek		Surgical tool
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362	Purify Endotoxin free plasmid DNA
5 ml pipette	Corning costar	4487	dissociate brain tissue