Summary
이 원고는 위와 더 낮은 기도의 점 막 내벽 액체 (MLF)을 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 특히 비 강 및 기관지 흡수 기술의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 더 나은 표준화 및 기존 호흡기 샘플링 기법 보다 내성 제공합니다.
Abstract
비 흡수 (NA)과 기관지 흡수 (바)의 방법 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 인간의 호흡기의 점 막 내벽 유체 (MLF)을 흡수. 나, 비 열 등에서 액체를 흡수 하 고 최소한의 불편을 초래 하는 비-침략 적 기술입니다. 나는 상부 기도의 샘플링을 자주 반복 하는 기능 재현 가능한 결과 얻지 못했다.
비교 함으로써, 호흡기 점 막, 비인 두 포부 (경찰청) 등 기존의 보라고 샘플링의 대체 방법을 더 침략 적 이며 큰 데이터 변화 될 수 있습니다. 다른 방법 제한, 예를 들어, 생 검 및 기관지 절차는 침략 적가 래 포함 많은 죽은 죽어 세포 하며 액 화, exhaled 호흡 응축 (EBC) 포함 물과 타 액, 및 게 샘플은 희석과 변수입니다.
바 병원에 bronchoscope의 작업 채널을 통해 수행할 수 있습니다. 샘플링은 잘 용납 하 고 기도에 여러 사이트에서 수행할 수 있습니다. 바는 MLF 샘플 bronchoalveolar 게 (BAL) 샘플 보다 덜 묽 게 되 고 결과.
이 문서에서는 NA, BA의 기법 뿐만 아니라 원하는 다운스트림 biomarker 측정 되 고에 지 어질 수 있다 결과 샘플의 실험실 처리 합니다. 이러한 흡수 기술을 임상 호흡기 연구에 사용 되는 기존의 샘플링 기법 유용한 대안입니다.
Introduction
대부분의 호흡기 질환 염증 반응, 원인과 알레르기 비 염, 바이러스 및 곰 팡이 감염, 결핵, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐에 호흡기 점 막 표면에서 샘플링에 대 한 긴급 한 필요가 있는 섬유 증 및 폐 암 1. 비인 두 aspirate (경찰청), 코 게 고 bronchoalveolar 게 (BAL) 위와 더 낮은 기도 샘플링에 대 한 일반적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 현재 가난한 내성, 염증 성 중재자의 희석 및 샘플링2를 자주 반복 하는 무 능력을 포함 하 여 상당한 문제. 경찰청 샘플링 한 대안 면봉, 몰려들었다 나일론, 면의 사용 이다 또는 레이 온3,4, 하지만이 또한 한계를가지고, 이후 그들은 불편 하 고 비 강 상피, 그리고 일부 경우 돌이킬 수 없는 바인딩의 손상을 일으킬합니다 염증 성 중재자5. 이러한 기술은 일반적으로 한 시간 이상 연속적으로 반복 수 없습니다 그리고 대체 기술을 더 낮은 풍부 cytokines 및 발산5,6의 검출에 대 한 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 이러한 기술과 관련 된 사용자 가변성 데이터를 더 큰 환자 동료의 요구의 결과로에 불일치를 생성할 수 있습니다.
또는, 천연 및 합성 스폰지를 사용 하 여 흡수 기술 점 막 표면에서 MLF 수집 하 사용 되었습니다. 안과 스폰지 천연 펄프 (예를 들어, Weck cel)의 구성 샘플 타 액, 자 궁 경부 및 질 분 비 물7에 사용 되었습니다. 또한, 폴 리 비닐 알코올 (PVA)에서 만든 합성 갯 솜 그리고 hydroxylated 폴 리 비닐 아세테이트 (HPVA) 활용된8되었습니다. 7 다른 흡수 성 물자 폴리우레탄 미니 스폰지 인간의 눈물10수집 하 사용 되었다 항 체9, 측정 전에 구두 액체를 샘플링에 대 한 비교 되어 있다.
필터 종이 면 식물에서 자연 섬유의 구성 된 알람 및 199211,12,,1314, 동료의 선구적인 종이부터 비 강 분 비 물 흡수에 널리 이용 되는 15,,1617. 필터 종이 디스크 필터 카드 (예: Shandon)에서 생산 되어 고 후 비 강 알레르기 문제를 제어와 자연 알레르기 노출18,19 histamines 및 cytokines를 측정 하기 위해 활용 ,,2021. 그러나, 필터 종이의 다른 배치 단백질 바인딩 및 cytokines를 풀어 몇 가지 실패의 그들의 정도에서 변화 한다. 합성 흡수 성 매트릭스 (SAM)를 사용 하 여 방법 따라서 개발된2,,2223되었습니다. SAMs는 지금 일반적으로 사용 코 MLF를 없음. 이 흡수 성 물자는 편안 하 게 사용 하 고 얻을 수 있습니다 MLF 염증된 코 에서도 자주 시간의 연장된 기간 동안.
비 흡수는 SAM을 사용 하 여 상부 기도에 MLF의 샘플링에 대 한 정밀 점 막 샘플링의 형태입니다. 나 장치 의료 등급 재료 클린 룸을 사용 하 여 의료 기기 CE 표시로 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. NA 샘플러 핸들 및 샘 메 마른 cryotube에 구성 됩니다. 고분자, 일반적으로 섬유, 이루어져 SAM 하지만 그것도 거품으로 사용할 수 있고 이러한 부드럽고 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking으로 흡수 되도록 선택 됩니다. SAMs는 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩. 나는 모든 나가의 기증자에 수행할 수 있는 매우 온화 하 고, 비-침략 적 기술입니다. 또한, 직렬 샘플링, 심지어 몇 분 마다 가능입니다. 나 샘플링 기법5 기존의 상부 기도 대 한 검증 및 반복적인 샘플링 알레르기23,,2425, 기도의 도전 다음 운동 데이터의 생성을 허용 했다 세균도26 그리고 바이러스 형 TLR 촉진제 (Jha, A. 외., 원고 준비에서). 나는 또한 유아 아 토 피27,,2829 의 자연의 역사를 조사 하 고 바이러스 성 기관지염30에 사용 되었습니다.
Bronchoscopic microsampling (BMS)은 올림푸스31,,3233에 의해 개발 된 더 낮은 기도에 MLF의 컬렉션에 대 한 절차입니다. 불행 하 게도,이 BMS 시스템은 일본에서 라이센스만. 두 BMS 시스템을 공급 하는 올림푸스: 섬유 hydroxylated 폴리에스터 (FHPE) 하나34,35,,3637, 프로브 및 하나는 목화와 함께 조사33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. 주요 걸림돌 블록 천식 환자에서 사용 하는 BMS 프로브 출혈, 혈액으로 오염 하는 모든 샘플의 절반 점 막 접촉 발생 되었습니다. 저자는 그것이 가능한 샘플 MLF 천식 환자43주변 항공에서이 BMS 시스템을 사용 하 여 결론을 내렸다.
대신, 바 이노6천식의 실험적인 감염 다음을 포함 하 여 더 낮은 기도의 bronchoscopic 조사 하는 동안 수행할 수 있는 부드러운 샘을 사용 하 여 개발 했습니다. 바 장치 구성: 외부 빈 카 테 테 르, 그 활성화에는 샘을 밀어냅니다 손을-조각 및 그것의 끝에 샘을 가진 중앙 플라스틱 가이드 와이어. 나, 서 바 키트 클린 룸을 사용 하 여 의료 등급 재료에서 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. 또한, 장치는 CE 표시 및 감마 방사선을 제공 됩니다. 샘 스트립, 흡수, 부드러운 이며 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking 있다. 그것은 또한 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩이 있다. 장치를 빠르게 사용할 수 있는 고 MLF는 기도 내 관심의 특정 사이트에서 샘플을 정확 하 게는 bronchoscope의 작업 채널을 통해 들어갈 수 있는. 발 또는 BMS와 달리 바 접촉 출혈 또는 수술 후 환자의 불편 함이 추가 되지는지 않습니다.
NA, BA 샘플의 처리에 신중한 고려를 주어져야 한다. 샘플 수 직접 냉동 고 일괄, 처리 또는 즉시 처리할 수 있습니다. 처리 유형 immunoassays cytokines, 발산 및 면역 글로불린, 또는 바이러스 성, 세균성, elutions를 포함 하 여 특정 다운스트림 응용 프로그램으로 맞출 수 있습니다 및 호스트 셀 RNA. 우리 임상 수집 및 연구소 임상 연구자에 대 한 가이드로 나 및 바와 관련 된 처리 기법 제시.
Protocol
다음 프로토콜에 사용 되는 기법 있다 서쪽 런던 연구 윤리 위원회 (참조 번호 15/소호/0444)에 의해 승인 되었습니다.
1. 비 흡수 (없음)
-
나 샘플링 이전 준비
- 나를 들고 먼저 손을 씻고 고 장갑, 가급적 환자 앞에 넣어.
- 머리 토치를 사용 하 여 비 강 검사 그리고 그들의 비 지배적인 엄지를 사용 하 여 코 구멍을 시각화 하는 환자의 코를 철회 하는 임상.
참고: 비 강 검 경 일반적으로 필요 하지 않습니다. - 비 강 및 샘플링 이전 비 등을 시각화.
참고: 네어스 (콧구멍) 횡단면에서 라운드 하지 않습니다 그리고 그들은 바로 뒤로 서. 일반적으로, 비 열 등 돌출 또는 측면 벽에는 콧구멍의 들여쓰기로 볼 수 있습니다 비 강 심장으로 형성 매끄러운, 평면 내측 벽. 우리가 하려는 열 등에서 샘플 비, 기본 상피 이기 때문에 호흡기44의 간단한 ciliated 상피.
-
나 샘플링
- 샘플링, 비 열 등에 대 한 평면 그것을 orientating는 콧구멍의 루멘을 부드럽게 나 샘을 전달.
- 비 강 점 막에 샘을 집게 손가락을 사용 하는 기증자를 요구 하십시오. 나는 약간 격 이네요, 가능한 눈 급수와 MLF 흡수 될 수 있습니다.
참고: 성인, 우리 일반적으로 성능이 나 60 s. - MLF의 흡수, 후는 콧구멍에서 나 장치를 제거 하 고 다시 원래 튜브에 넣어.
- 실험실에서 즉시 샘플을 처리 하거나이 프로토콜의 뒷부분에 설명한 대로, 그들을 동결.
참고: 나는 다양 한 비 강 점 막 도전 모델, 그리고 다른 기도 질병 공부 되는. 그러나, 각 연구와 환자 인구에 대 한 다른 호흡기 샘플링 방법에 대 한 유효성 검사를 수행 합니다.
2. 기관지 흡수 (BA)
-
바 샘플링 이전 준비
참고: 바 전문된 인력 상계 제품군에 의해 수행 됩니다.- 테 내려 바 장치를 배치 하기 전에 SAM은 압출 하 고 카 테 터로 다시 철수를 확인 합니다.
- 바 환자에 실시, 사전 모의 바 상계 시뮬레이터에 실시 합니다.
-
바 샘플링
- 기도와 오른쪽 주 기관지 bronchoscope는 기관지 intermedius, 그냥 오른쪽 하단 및 오른쪽 중간 엽으로 사단을 인접의 수준에 전달 합니다.
참고: 우리가 일반적으로 샘플 기관지 intermedius에서 비록 기도 내의 다른 사이트를 샘플링할 수 있다. 카 테 터와 샘 관찰, 하나 bronchoscope 팁을 볼 수 없습니다. 우리는 bronchoscope 원하는 샘플링 사이트에 도달 했습니다 일단 바에 대 한 다음과 같은 간단한 단계를 관찰 합니다. - 화이트 팁 그냥 최대 1cm는 bronchoscope의 끝에 말 초 기도에 표시 될 때까지 아래로 카 테 터: 바 테는 bronchoscope의 동작 채널을 통해 삽입 합니다. 기도의 루멘의 중심에서 bronchoscope 및 카 테 터 팁을 유지. 카 테 터 팁과 마모는 점 막 하의 위험을 줄이기 위해 기관지 점 막의 접촉을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 샘 아웃: SAM 오른쪽 중간 또는 오른쪽 하단 엽 기도의 루멘으로 돌출 되도록 핸들 바 장치의 우울. 직접 비전 않도록 하는 샘은 기도 벽에 MLF 접촉 bronchoscope의 끝을 구 부. 30 점 막 벽에 평면 기도, 내 샘을 두고 s.
- 샘에: 습 한 샘 프로브는 되도록 직선과 하지 구부러진 카 테 터의 끝에 다시 bronchoscope을 통해 봐. 필요한 경우, 카 테 터와 bronchoscope 팁 SAM을 다시를 주어질 수 있다. 직접 비전, 카 테 터에 다시 직선 샘을 부드럽게 철회.
참고: 경우에 카 테 터에 다시 샘을 제거 하는 어려움, 샘과 전체 장치 철수 기도에서 다시 내밀 었 다. - 카 테 터:는 bronchoscope의 동작 채널에서 전체 카 테 터를 철수.
- 샘을 잘라: SAM 멸 균가 위로 잘라 고 얼음에는 cryotube에 넣어. 이 샘플은 다양 한 방법으로,이 프로토콜에 나중으로 처리할 수 있습니다.
- 기도와 오른쪽 주 기관지 bronchoscope는 기관지 intermedius, 그냥 오른쪽 하단 및 오른쪽 중간 엽으로 사단을 인접의 수준에 전달 합니다.
3입니다. 나 및 바 샘플 처리
참고: 나와 바에서 발생 하는 샘플의 실험실 처리에 대 한 다양 한 옵션을 확인 하 고 있습니다. 이러한 프로토콜은 나중에 사용 하기 위해 샘플을 저장 하 고 SAM에서 MLF 샘플 elute 추구 합니다.
-
NA, BA 샘플의 즉각적인 처리에 대 한 옵션
- 옵션 1: 추가 처리 전에 몇 시간 동안 얼음에 습 한 샘을 저장 합니다.
- 옵션 2: 즉시 딥 프리즈 나 SAMs 컬렉션에 관. 마찬가지로,가 위, 샘플링 장치에서 제거 후, 극저온 튜브에 바 SAMs 동결.
- 옵션 3: 직접 또는 깊은 동결 처리 이전 차입 버퍼 (300 µ L)에서 분리 된 샘을 놓습니다.
-
NA, BA 샘플에 대 한 차입 버퍼의 옵션
참고: MLF 샘플에서 분석 하는 것에 따라 차입 버퍼 선택 하 고 우리는 4 개의 주요 대안을 제안:- 미리 준비 된 분석 결과 버퍼 immunoassay 절차에 대 한 적합 한 사용. 이러한 버퍼 뿐만 아니라 단백질, 예를 들어, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1% 적은 양의 세제 (0.05%)를 포함 해야 합니다.
- 또는 사용 하 여 세제의 큰 금액을 포함 하는 버퍼 세포 세포의 용 해 발생 합니다.
참고: 우리는 1% 농도에서 트리톤 X 또는 NP40를 포함 하는 버퍼를 사용 합니다. 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 SAM에서 eluted 수 cytokines와 발산에에서 일반적으로 결과 세포내와 세포 외 cytokines. 이러한 버퍼 단백질, 포함 되어야 하 고 1 %BSA 함께 만들어집니다. - 바이러스 성 RNA 또는 측정 호스트 RNA의 양이 많은 PCR 같은 RNA 측정에 대 한 습 한 샘에 직접 RNA 추출 버퍼를 추가 합니다.
참고: Chaotropic RNA 추출 버퍼 guanidinium 변성 단백질을 포함. 대안은은 immunoassay 또는 세포 세포의 용 해 버퍼에 포함 된 eluted MLF 액체에 RNA 추출 버퍼를 추가 하는 것 이다. - Trifluoroacetic 산 등의 유기 용 매를 사용 하 여 지질과 대사 산물, 질량 분석 평가 대 한의 추출.
참고: 이러한 모든 시이 약의 세부 자료 섹션에 포함 됩니다.
-
차입 기법
- 위의 차입 기법 중 하나에 대 한 원하는 추출 버퍼 함께 2 mL 마이크로 원심 튜브에 SAM를 삽입 합니다.
- 소용돌이 혼합 30에 대 한 샘플을 느슨하게 연결 된 체액 및 생체의 샘을 씻어 s.
- 전체 샘플 복구를 보장 하기 위해, 습 한 샘 열을 추가 스핀 필터 미니에 사용 된 동일한 2 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 삽입 하 여 원심 차입을 수행 합니다.
참고: 두 가지 유형의 회전 필터 미니 열을 사용할 수 있습니다. 첫 번째 장소에서 SAM을 보유만 플라스틱 메쉬를 체액의 전체 차입을 허용 포함 되어 있습니다. 또는, 전염 성 재료를 사용 하는 경우 0.22 μ m 기 공 크기와 회전 필터를 사용 합니다. 이러한 필터 샘플을 소독 하 고 의심 Mycobacterial 감염 샘플에 적합. 그러나, 이러한 필터 버퍼, 일반적인 상호 작용을 통해 필터에 중재자의 바인딩을 최소화 하 미리 incubated 이어야 한다. - 소독된 집게를 사용 하 여 회전 필터에 습 한 샘을 전송. 집게를 오염을 방지 하기 위해 샘플 사이 변경 합니다.
- 4 ° c 원심 분리기 샘플 미니 원심 분리기에서 16000 x g에서 20 분 동안 냉각
-
요약 예제 프로토콜
- 실험실에서 라벨 2 mL 샘플 컬렉션에 대 한 마이크로 원심 튜브 및 차입 버퍼의 원하는 볼륨을 추가 (NA;에 대 한 일반적으로 300 µ L 바에 대 한 100 µ L). 뚜껑을 밀봉 하 고 얼음에 놓습니다.
- 샘플링 (즉시 또는 실험실에서) SAM 다음 집게를 사용 하 여 핸들에서 제거 하 고 컬렉션 튜브 (이전 단계에서 생성)를 포함 하는 버퍼에 배치 됩니다. Microcentrifuge 튜브의 뚜껑은 안전 하 게 닫히고 얼음, 추가 처리를 위해 실험실에 샘플을 전송 확인 하십시오.
- 30에 대 한 그들의 전송 컨테이너와 소용돌이 믹스에서 샘과 차입 버퍼를 포함 하는 튜브를 제거 s.
- 소독 집게를 사용 하 여 샘을 제거 하 고 (또는 0.22 μ m 셀 루 로스 아세테이트 필터 없이) 스핀 열에 배치.
- 컬렉션 튜브에서 차입 버퍼를 수집 하 고 유지.
- 스핀 열, 샘, 원래 컬렉션 튜브 (또는 살 균 필터링 하는 경우 새로운 한 샘플링) 열 회전 컬렉션 버퍼를 추가. 이러한 방식으로 세척 액체 elute SAM에서 샘플을 수집 관으로 다시 회전 열을 통해 전달 합니다.
- 뚜껑 봉인 (16000 x g, 20 분, 4 ° C) 샘플을 원심.
- 원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 선반에 장소.
- 튜브의 밀폐 뚜껑 열고 SAM를 포함 하는 스핀 열을 제거 합니다. 샘과 스핀 열에 적절 한 폐기물 컨테이너를 삭제 합니다.
- 신중 하 게 약 수로 튜브 내에 포함 된 eluate 이라는 극저온 튜브 합니다. 각 약 수에 eluate의 총 볼륨 및 볼륨을 기록 합니다.
- -80 ° C 냉장고에 밀봉된 저온 관 전송 및 사용까지 똑바로 저장.
Representative Results
없음은 쉽게 다양 한 연구에에서 이용 되어 고 비 접촉 측정 점 막 염증. 코에 알레르기의 관리, 다음 스타 글란 딘-d 2 (PGD2) 수준 상승 하 고 분 (그림 1), 돛대 세포 degranulation (트와 츠 외, 원고 준비 중) 맞춰가 관찰할 수 있습니다. 또한, 중재자 타입 II 염증, IL-5 (그림 2, 24에서 허가로 증 쇄 하는), 등의 비 강 알레르기 도전23,24다음 시간에 측정할 수 있습니다. 알레르기 천식과 건강 한 컨트롤의 실험적인 감염, 나는 7 일 (그림 3, 6에서 허가로 증 쇄 하는)의 과정을 통해 인터페론 감마 (IFN-γ)를 포함 하 여 중재자의 패널을 측정 하 사용 되었다. 또한, 유아의 자연 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염, 나 비-RSV 기관지염와 건강 한 컨트롤 ( 유아 상대적인 IFN-γ 등 염증 성 cytokines의 높은 수준의 연관 RSV를 시연 그림 4, 30의 허가 함께 재발급). 흥미롭게도, RSV와 비-RSV 기관지염이이 차별 시간 일치 경찰청 샘플 (그림 4)에 중요 했다.
바 이노와 알레르기 천식의 실험적인 감염 동안도 사용 되었다. 하루의 4 rhinovirus 감염, 레벨의 IFN-γ, CXCL11에서 IL-10과 IL-5 기준선 (그림 5;에서 상승 했다 A, B, C, D, 각각). 또한,이 기술은 건강 한 컨트롤 (그림 5D) (그림 5 6에서 허가로 증 쇄 하는)을 기준으로 라 이노 바이러스 감염 시 알레르기 천식의 낮은 기도에 높은 IL-5 레벨을 시연 했다.
이러한 대표적인 결과 eluted 0.05% 트윈-20 및 1 %BSA 포함 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 샘플에서 생성 된 ( 재료의 표참조).
그림 1 : 빠른 생성 및 비 강 알레르기 도전 다음 스타 글란 딘-d 2의. 디 모 데 잔디 꽃가루와 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 샘플에 비 흡수 있다에서 스타 글란 딘-d 2 (PGD2)의 레벨 측정 (n = 5). 각 줄은 한 개인에서 데이터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : IL-5 비 강 알레르기 도전 다음의 운동 측정. 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 비 흡수 샘플에서 IL-5의 생산. 3 알레르기 도전 연구를 실시 했다, 참가자와 함께 반복 (n = 19) 위약 (파란색)을 받고, 낮은 복용량 (10 mg) 경구 프레드 니 손 (오렌지), 또는 높은 복용량 (25mg) 경구 프레드 니 손 (빨간색) 알레르기 관리 이전 1 시간. 라인은 표시 하 고 오차 막대는 모든 참가자의 95% 신뢰 간격. (그림 2017 Leaker 외, 점 막 면역학에서 허가로 증 쇄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Rhinovirus 감염 시 인터페론-γ의 유도. 건강 한 성인의 감염 도전 중 (n = 11, 블루)와 알레르기 천식 (n = 28, 레드) 이노-16, 비 흡수 샘플링 인터페론-γ (IFN-γ)의 레벨을 측정 하기 위해 사용 되었다. 데이터는 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 개인 및 B) 중간 레벨의 A) 원시 스파게티 플롯으로 표현 됩니다. (그림은 헨젤과 그 외 여러분 에서 허가로 증 쇄 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Nasosorption 유아의 RSV 감염 연관 높은 인터페론-γ 차별. 비 흡수와 비인 두 열망 (경찰청) 기관지염 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염과 관련 된 유아의 인터페론-γ 수준을 측정 하는 데 사용 했다 (빨강, n = 12), 비-RSV 호흡기 병원 체 (녹색, n = 12), 그리고 건강 한 컨트롤 (블루, n = 9). 데이터 Kruskall-월리스 테스트를 사용 하 여 여러 비교를 Dunns 정정 분석 했다 (* * *p< 0.001). 라인 중간 값 나타냅니다 있으며 오차 막대 interquartile 범위. (트와 츠 외 허가 수정 그림 30). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 기관지 흡수 샘플 rhinovirus 감염 동안에 염증 성 중재자.
건강 한 컨트롤의 이노 16 감염 다음 (n = 10, 파랑) 및 알레르기 천식 자원 봉사자 (n = 23, 레드), 기관지 흡수 기준선에와 감염의 날 4 D) IL-5, C) IL-10, B) CXCL11, A) IFN-γ의 수준을 측정 하는 데 사용 되었다. 데이터 Wilcoxon 분석 평가 테스트 (일치 샘플)와 맨-휘트니 테스트 (최고의 샘플) 서명. 헨젤 외 에서 허가로 증 쇄 하는 그림 6 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
기존 기도 샘플링 기법에서 결과 높은 변수;로 간주 다른 샘플링 기법 표준화 연구5이 분야 내에서 필요 합니다. NA, BA 비-침략 적 방식으로 MLF의 샘플링을 허가 있고 흥미로운 가능성이 건강 하 고 병 항공에 면역 반응 측정. 이 제공 하는 수많은 잠재적인 이점이 큰 내성, 샘플링의 속도, 샘플링, 자주 반복 하는 기능을 포함 하 여 기존 기술, 낮은 간 사용자 가변성, 기술과 면역 중재자5의 희석을 감소 . 기간 흡수 및 사용 처리 기술을 각 연구에 대 한 최적화와 샘플링 이벤트 사이 엄격 하 게 유지 있어야 합니다. 또한, 학사, 경우 기도 내에서 샘플링의 사이트 복제 되어야 합니다 신중 하 게 개인 사이.
나, 그리고 특히 바, 임상 연구에 대 한 여전히 비교적 새로운 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술의 장점을 대체 기법5에 대 한 주의 유효성 검사를 포함 하 여 수많은 연구에 그들의 사용에서 이어지고 있다. 이 소자 들은 CE 표시 장치 호흡 연구에서 광범위 한 사용에 대 한 준비로 지금입니다. NA, BA 대체 샘플링 기법 보다 훨씬 작은 샘플 볼륨에서 결과, 반면 높은 획득된 농도 낮은 풍부한 면역 중재자에 대 한 감도 향상 될 수 있습니다.
원하는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 NA, BA 샘플 수 직접 동결 이후 처리, 임상 연구 환경에서 연구 타당성을 강화. 샘플 처리에 대 한 프로토콜 특정 다운스트림 응용 프로그램에 맞게 적용할 수 있습니다. 제안된 처리 기술을 단백질 또는 지질 면역 중재자 또는 핵 산의 컬렉션에 사용할 수 있지만 각 연구에 대 한 최적화 되어야 합니다. 특히, MLF 다른 버퍼가 eluted 될 수 있습니다. 첫째, 점 막 cytokines, 발산, 및 항 체6,45측정 immunoassay 버퍼를 사용할 수 있습니다. 세제 상부와 버퍼 또한 세포내 cytokines의 포함을 허용 하는 세포 세포 발생을 보장 하기 위해 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 감염, 바이러스 성 결정에 대 한 버퍼를 사용 한다 Chaotropic RNA 추출 로드, mRNA과 미생물. 또는, lipidomics 및 질량 분석에 대 한 유기 용 매를 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 점 막 표면에서 직접 흡수 MLF의 호흡, 위장, 비뇨 생식 기, 및 다른 점 막 질환에서 잠재적인 사용 흥미로운 기술입니다. 그러나, 이러한 유망한 흡수 기술을 샘플링 및 개별 분석 (biomarkers) 각 질병에에서 대 한 기술 처리의 정확한 확인이 필요 합니다. 또한, 이러한 소설 정밀 점 막 샘플링 기법 혈액, 호흡, 및가 래와 같은 기존 샘플에 대 한 유효성 검사를 요구할 것 이다. 이러한 기법, MLF 미생물, cytokines, 발산, prostanoids, 및 항 체를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 여 제휴에서 건강 연구 (NIHR) 생물 의학 연구 센터 (BRC) 대 한 제국 국가 연구소, NIHR 건강 보호 연구 단위 (HPRU)에 제국 대학 런던에서 호흡기 감염에서 자금 지원 자금: 공중 보건 영국 (PHE)와 NIHR 제국 환자 안전 변환 연구 센터. 표현 그 저자와 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건 또는 공중 보건 영국 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
| Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
| Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
| NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
| Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
| 2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |
References
- Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
- Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
- Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
- Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best? Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
- Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
- Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
- Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
- Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
- Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
- Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
- Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
- Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M.
- Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
- Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
- Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
- Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
- Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
- Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
- Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
- Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
- Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
- Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
- Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
- Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
- Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
- Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
- Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
- Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
- Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
- Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).
