JoVE Journal Medicine

Medicine

Поглощение носовой и бронхиальной жидкостей: точность выборки человека слизистой оболочки дыхательных путей и лаборатория обработки образцов

Published: January 21, 2018 doi: 10.3791/56413

Ryan S Thwaites¹, Hannah C Jarvis¹, Nehmat Singh¹, Akhilesh Jha¹, Andy Pritchard², Hailing Fan¹, Tanushree Tunstall¹, Joan Nanan¹, Simon Nadel², Onn Min Kon², Peter J Openshaw¹, Trevor T Hansel¹

¹National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London, St Mary's Hospital, ²St Mary's Hospital, Imperial College Healthcare Trust

Summary

Эта рукопись описывает использование методов носовой и бронхиальной поглощения, специально с использованием синтетических освоения матрицы (SAM) для выборки слизистую жидкость (МЗФ) верхних и нижних дыхательных путей. Эти методы обеспечивают лучшую стандартизации и переносимости, чем существующие методы дыхания выборки.

Abstract

Методы носовой поглощения (NA) и бронхиальной поглощения (BA) использовать синтетические освоения матрицы (SAM) поглощать слизистую жидкость (МЗФ) человека дыхательных путей. NA — это неинвазивный метод, который поглощает жидкости из нижней носовой раковины и вызывает минимальный дискомфорт. NA принесло воспроизводимость результатов с возможностью часто повторять выборки верхних дыхательных путей.

Для сравнения альтернативные методы выборки слизистую дыхательных, например носоглотки аспирации (НПД) и обычных моечные, более инвазивных и может привести к большей изменчивости данных. Другие методы имеют ограничения, например, биопсии и бронхиальной процедуры являются инвазивными, мокрота содержит много мертвых и умирающих клеток и требует сжижения, конденсата выдыхаемого воздуха (EBC) содержит воду и слюны и промывание образцы разреженных и переменная.

Ба может быть выполнена через рабочий канал бронхоскоп в клинике. Отбор проб переносится хорошо и может проводиться в нескольких местах в дыхательные пути. BA приводит в образцах МЗФ, будучи менее разбавить чем Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) образцов.

Эта статья демонстрирует методы NA и ба, а также Лаборатория обработки результирующей образцов, которые могут быть приспособлены к желаемой течению биомаркер измеряется. Эти методы поглощения являются полезной альтернативы обычной выборки методов, используемых в клинических исследованиях дыхания.

Introduction

Большинство респираторных заболеваний вызывают воспалительной реакции, и существует настоятельная необходимость для отбора проб с поверхности слизистой оболочки дыхательных путей в аллергический ринит, вирусные и грибковые инфекции, туберкулез, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, легочные фиброз и легких Рак ¹. Носоглотки аспирационная (НПД), промывание носа и Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) являются общие методы для отбора проб верхних и нижних дыхательных путей. Однако эти методы представляют значительные проблемы, включая плохой переносимости, разбавление воспалительных медиаторов и неспособность часто повторять выборки². Одной из альтернатив НПД выборки является использование тампонов, стекались нейлон, хлопок, или район³^,⁴, но они также имеют ограничения, так как они вызывают дискомфорт и повреждений носовой эпителий, а в некоторых случаях необратимые связывание ⁵воспалительных медиаторов. Эти методы обычно не могут повторяться серийно более часа, и альтернативные методы могут быть более эффективными для обнаружения низкого залегания цитокинов и chemokines⁵^,⁶. Кроме того изменчивость пользователя, связанные с этими методами могут генерировать несоответствия в данные, в результате чего требование больше пациентов когорт.

Кроме того были использованы методы поглощения с использованием как естественных, так и синтетические губки для сбора МФ от слизистых поверхностей. Офтальмологических губки состоят из натуральной целлюлозы (например, Weck чел) были использованы для образцов слюны, шейки матки и⁷из влагалища. Кроме того синтетические губки из поливинилового спирта (ПВС) и Гидроксилированные поливинилацетатные (HPVA) были использованного⁸. Семь различных освоения материалы были по сравнению для отбора проб ротовой жидкости до измерения антитела⁹, хотя полиуретановые мини губки были использованы для сбора человека слезы¹⁰.

Фильтровальная бумага, состоящий из натуральной целлюлозы из хлопчатника широко используется поглощать носовых выделений с новаторской бумаги Алам и коллег в 1992 году¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^, ¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Картоны фильтровальные диски были произведены из фильтра карты (например Шандон) и были использованы для измерения гистамина и цитокинов, после того, как контролируемые носовой Аллерген проблемы и с естественной Аллерген воздействия¹⁸^,¹⁹ ^,^,²⁰²¹. Однако различные пакеты фильтровальной бумаги различаются по степени их связывания белков и некоторые не выпустить цитокинов. Поэтому методы, с помощью синтетических освоения матрицы (SAM) были развитые²^,²²^,²³. Самс теперь обычно используются для получения носовой МЗФ NA. Эти абсорбирующие материалы удобно использовать и получить МЗФ даже от воспаленных Носов промежутки более продолжительных периодов времени.

Носовые поглощения является формой точности слизистой выборки с использованием Сэм для выборки МФ в верхних дыхательных путей. NA устройства производятся как CE помечен медицинские приборы из материалов медицинского назначения с использованием чистых помещений и свободны от аллергенов и пыли. Сборники NA состоит из ручки и Сэм в стерильный cryotube. Сэм состоит из полимеров, обычно волокон, но он также доступен как пена, и эти выбраны быть мягкой и освоения, с быстрым влагу для сбора проб. Самс имеют минимальный белка привязки позволяют эффективно элюции всасывается выделениями. NA это очень нежный, неинвазивная техника, которая может быть выполнена на доноров всех возрастов. Кроме того последовательной выборки, даже каждые несколько минут, возможно. NA были проверены против существующих верхние дыхательные пути отбора методов⁵ и повторяющихся выборки позволил кинетических данных после вызов дыхательных путей с Аллерген²³^,²⁴^,²⁵, бактериальных эндотоксинов²⁶ и вирусный тип TLR агонистов (Jha, A. et al., рукопись в подготовке). NA также был использован в грудных детей для изучения естественной истории Атопия²⁷^,^,²⁸²⁹ и вирусных бронхиолит³⁰.

Бронхоскопические microsampling (СЭЗ) является процедура сбора МЗФ в нижних дыхательных путей, что был разработан Olympus³¹^,^,³²³³. К сожалению эта система BMS лицензируется только в Японии. Olympus две БМС систем теплоснабжения: один с волокнистыми Гидроксилированные полиэстер (FHPE) датчик³⁴^,^,³⁵³⁶^,³⁷, и один с хлопком зонд³³^,³⁸^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³. основным камнем преткновения был зонд БМС, используемый в больных астмой вызвало слизистой контакт, кровотечение, с половины всех образцов, загрязненные кровью. Авторы пришли к выводу, что было невозможно для образца МЗФ, с помощью этой системы BMS от периферийных airways в астма пациенты⁴³.

В качестве альтернативы мы разработали Ба с помощью мягкой Сэм, которая может быть выполнена во время Бронхоскопическое расследования нижних дыхательных путей, включая следующие экспериментальной инфекции астматические субъектов с риновирус⁶. Ба устройство состоит из: внешние полый катетер, рука кусок, который на активации выдавливаются SAM и Центральный пластиковый руководство провод, имеющий SAM на его конце. Что касается NA Ба комплекты изготавливаются из материалов медицинского назначения с использованием чистых помещений и свободны от аллергенов и пыли. Кроме того устройства являются CE помечен и предоставляются гамма облучению. Стрип Сэм мягкие, освоения и быстрое влагу для сбора проб. Она также имеет минимальный белка привязки позволяют эффективно элюции всасывается выделениями. Устройство может поместиться через рабочий канал бронхоскоп и может использоваться для быстрого и точного образца МФ на конкретные сайты, представляющие интерес в дыхательные пути. В отличие от бал или СЭЗ Ба не приводит к контактные кровотечения или дополнительные пациента дискомфорт после процедуры.

Тщательное внимание должно уделяться обработки образцов NA и ба. Образцы могут быть непосредственно заморожены и обрабатываются в пакетах или могут обрабатываться немедленно. Тип обработки могут быть приспособлены к определенным нисходящие приложения, включая иммуноанализа цитокины, chemokines и иммуноглобулины или смывах вирусных, бактериальных, и клетки-хозяина, связанных РНК. Мы представляем клинических коллекции и лабораторных методов обработки, связанные с NA и ба как руководство для клинических исследований.

Protocol

Методы, используемые в следующий протокол были одобрены Комитет этики исследований Западный Лондон (справочный номер 15/Ло/0444).

1. носовые поглощения (NA)

Подготовка до NA выборки
1. При проведении NA, сначала вымойте руки и надел перчатки, предпочтительно перед пациента.
2. Осмотрите носовой полости, используя голову факел и у врача использовать их недоминирующее пальца отозвать носа пациента для визуализации полости носа.
  Примечание: Носовое зеркало обычно не требуется.
3. Визуализация носовой полости и нижней носовой раковины до выборки.
  Примечание: Ноздри (ноздри) не круглая в сечении, и они идут прямо назад. Как правило нижней носовой раковины можно рассматривать как выпуклость или отступ на боковой стенке ноздри, с носовой перегородки формирование гладкие, плоские медиальной стены. Мы хотим образца от этой нижней носовой раковины, поскольку основной эпителия является простой мерцательного эпителия дыхательных путей⁴⁴.
NA выборки
1. При отборе проб, передайте NA Сэм мягко вверх в просвет ноздрю, ориентация это плоский против нижней носовой раковины.
2. Попросите доноров использовать указательным пальцем нажать Сэм на слизистую оболочку носа. NA может вызвать незначительные щекотки, с возможным глаз полива, как МФ поглощается.
  Примечание: В взрослых, мы обычно выполняем NA для 60 s.
3. После поглощения МЗФ удалить устройство NA из ноздрей и положить обратно в оригинальный трубки.
4. Процесс образцы сразу в лаборатории или заморозить их, как описано позже в этом протоколе.
  Примечание: NA изучается в различных моделей носовой слизистой вызов, а также в различных airways заболеваний. Однако проверка против других методов дыхания выборки должен выполняться для каждого исследования и пациент населения.

2. бронхиальной поглощения (BA)

Подготовка до Ба выборки
Примечание: BA выполняется квалифицированным персоналом в люксе бронхоскопии.
1. Перед установкой устройства BA вниз катетер, проверьте, что Сэм экструзии и снятия обратно в катетер.
2. До проведения Ба на пациента, провести пробный Ба на тренажере бронхоскопии.
BA выборки
1. Передайте уровень бронхов щитомордник, просто проксимальнее разделение на правой нижней и правой средней долей бронхоскоп вниз трахеи и правого главного бронха.
  Примечание: Мы обычно выборки из бронха щитомордник, хотя можно попробовать другие сайты в дыхательные пути. При наблюдении катетера и Сэм, нельзя увидеть кончик бронхоскоп. Мы отмечаем следующие простые шаги для Ба, достигнув желаемого выборки сайт бронхоскоп.
2. КАТЕТЕРА вниз: Вставьте Ба катетер через рабочий канал бронхоскоп до белым кончиком видна только в дыхательные пути, максимум 1 см дистальнее конца бронхоскоп. Держите кончик бронхоскоп и катетер в центре просвете дыхательных путей. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму контакт между катетера и бронхиальную слизистую оболочку для снижения риска износу слизистой оболочки.
3. Сэм OUT: Угнетают дескриптор устройства Ба, так, что Сэм прессуется в Люмене сократимость право средней или правой нижней доле. Под прямое видение согните кончик бронхоскоп обеспечить, что Сэм делает контакт с МЗФ на стене сократимость миокарда. Покинуть Сэм в дыхательные пути, плоские к стенке слизистой оболочки для 30 s.
4. Сэм в: Взгляд через бронхоскоп для обеспечения прямой и не гнутые влажный зонд Сэма обратно на конце катетера. При необходимости, кончик катетера и бронхоскопа может быть снова выпрямить SAM. Под прямое видение отозвать прямой Сэм аккуратно обратно в катетер.
  Примечание: Если есть сложности, втягивая Сэма обратно в катетер, снять все устройство с СЭМОМ экструдированный обратно из дыхательных путей.
5. КАТЕТЕР вверх: Снять весь катетер из эксплуатации канала бронхоскоп.
6. CUT OFF Сэм: Сэм отрезан со стерильными ножницами и затем помещаются в cryotube на льду. Эти образцы могут быть обработаны с различными методами, как описано позже в этом протоколе.

3. обработка NA и ба образцов

Примечание: Есть множество вариантов для обработки лабораторных образцов, обусловленных NA и ба. Эти протоколы направлены для хранения образцов для последующего использования и элюировать МФ образца от SAM.

Параметры для немедленной обработки образцов NA и ба
1. Вариант 1: Храните влажные Сэм на льду за несколько часов до дальнейшей обработки.
2. Вариант 2: Немедленно Лютый NA МСОС в коллекции трубки. Аналогичным образом заморозить Ба МСОС в криогенных флаконов после удаления, с ножницами, от устройства выборки.
3. Вариант 3: Место отдельностоящий Сэм в Элюирующий буфер (300 мкл) до обработки прямо или глубокого замораживания.
Параметры буфера для образцов NA и ба
Примечание: Выбор Элюирующий буфер зависит от того, что собирается быть проанализированы в образце МФ и мы предлагаем четыре основных варианта:
1. Используйте заранее подготовленные пробирного буфер для иммуноферментного анализа процедур. Такие буферы должен содержать небольшое количество моющего средства (0,05%), а также белка, например, бычьим сывороточным альбумином (БСА) на 1%.
2. Кроме того используйте буфер, содержащий большее количество стирального порошка, так что происходит лизис клеток.
  Примечание: Мы используем буферов, содержащих Тритон-X или NP40 в концентрации 1%. Буферы лизис клетки позволяют внутриклеточные и внеклеточной цитокинов быть этого eluted от Сэма, и вообще привести к повышению уровня цитокинов и chemokines. Эти буферы должен также содержать протеин и составлены с BSA до 1%.
3. Для измерений РНК, например количественного PCR вирусной РНК или измерительного узла РНК РНК добыча буфера напрямую добавлять влажные Сэм.
  Примечание: Chaotropic РНК добыча буферы содержат Гуанидиновые, который денатурирует белки. Альтернативой является добавление РНК добыча буфер eluted МЗФ жидкости, содержащихся в буфере lysis иммуноанализа или ячейки.
4. Использование органических растворителей, таких как trifluoroacetic кислота, для извлечения липидов и метаболитов, для оценки по масс спектрометрии.
  Примечание: Подробная информация о всех этих реагентов включены в разделе материалы.
Элюирующий техника
1. Для любого из указанных выше методов элюции вставьте SAM в 2-мл пробирку микро центрифуги, наряду с желаемого извлечения буфер.
2. Вихревой смешать образца для 30 s мыть Сэм слабо прилагаемый жидкостей и биомолекул.
3. Для обеспечения восстановления полного образца, выполните центробежные элюции путем добавления влажные Сэм спин фильтр мини-колонки, который вставляет в же 2-мл пробирку микро центрифуга для стирки.
  Примечание: Могут использоваться два типа мини-колонки спин фильтр. Первый содержит только Пластиковая сетка, которая держит SAM в месте, позволяя полностью элюции жидкости. В качестве альтернативы если работа с инфекционными материалами, используйте фильтры спин с размером пор 0,22 мкм. Эти фильтры будут стерилизовать образцы и подходят для образцов с подозрением микобактериальной инфекции. Однако эти фильтры должны быть предварительно инкубируют с буфером, чтобы свести к минимуму привязки посредников к фильтру неспецифичные взаимодействия.
4. Используйте стерилизованные щипцы для передачи влажные Сэм спин фильтра. Изменить щипцы между выборками для предотвращения загрязнения.
5. Образцы центрифуги для 20 минут, 16000 x g в мини центрифуга охлаждается до 4 ° C.
Краткий пример протокола
1. В лаборатории, ярлык 2 мл микро-пробирок для сбора проб и добавить желаемый объем буфера (обычно 300 мкл для NA; 100 мкл для ба). Уплотнение крышки и место на льду.
2. После отбора проб (немедленно или в лаборатории) Сэм удаляется из дескриптора с помощью щипцов и помещаются в буфер, содержащий коллекцию трубки (созданный в предыдущем шаге). Обеспечить крышку пробки microcentrifuge надежно закрыт и передачи образцов, на льду, в лабораторию для дальнейшей обработки.
3. Удаление пробирки, содержащие Сэм и Элюирующий буфер из их передачи контейнеров и вихревой смеси для 30 s.
4. С помощью стерильный пинцет, удалите Сэм и поместить в столбец спин (с или без 0,22 мкм фильтром ацетат целлюлозы).
5. Собирать Элюирующий буфер из коллекции трубки и сохранить.
6. Место столбце спин с Сэм, в оригинальной коллекции трубку (или новый если стерильной фильтрации проб) и добавить коллекцию буфер для спина столбец. Таким образом мыть жидкости будет проходить через столбце спин обратно в коллекции трубу, помогая элюировать образца от SAM.
7. Центрифугуйте образцы с крышками герметичный (16000 x g, 20 мин, 4 ° C).
8. Удаление примеров из центрифуги и место в стойку.
9. Открыть крышку герметичных труб и удалить спина столбец, содержащий SAM. Распоряжаться Сэм и спин столбца в соответствующий контейнер для отходов.
10. Тщательно Алиготе, которую элюата, содержащихся в трубку в маркировке криогенных трубки. Запишите общий объем элюата и объем в каждом Алиготе.
11. Передача закрытых криогенных трубы в морозильной камере-80 ° C и хранить в вертикальном положении до использования.

Representative Results

NA использовался в ряде исследований, позволяющих легко и неинвазивным измерить воспаление слизистых оболочек. После отправления Аллерген в нос простагландин D2 (PGD2) уровнях можно наблюдать взлет и падение в течение нескольких минут (рис. 1), в соответствии с дегрануляции тучных клеток (Твэйтс et al., рукопись в подготовке). Кроме того медиаторов воспаления типа II, как Ил-5 (рис. 2, перепечатано с разрешения ²⁴), может быть измерена в после носовых Аллерген вызов²³^,²⁴часов. В экспериментальной инфекции аллергических астматиков и здоровых элементов управления NA был использован для измерения группа посредников, в том числе интерферон гамма (ИФН γ), в течение 7 дней (рис. 3, перепечатано с разрешения ⁶). Кроме того в естественных респираторно-синцитиальный вирус (RSV) инфекции новорожденных, NA продемонстрировал RSV ассоциироваться с повышенные уровни воспалительных цитокинов, таких как ИФН γ, относительно младенцев не RSV бронхиолит и здорового управления ( Рисунок 4, перепечатано с разрешения от ³⁰). Интересно, что эта дискриминация между RSV и не RSV бронхиолит не был значительным в соответствующее время НПД образцы (рис. 4).

Во время экспериментальной инфекции аллергических астматиков с риновирус использовался также ба. В день 4 риновирус инфекции, уровни ИФН-γ, CXCL11, Ил-10 и Ил-5 были повышенными от базовой линии (рис. 5; A, B, C и D, соответственно). Кроме того этот метод показал повышенные уровни IL-5 в нижних дыхательных путей аллергических астматиков во время инфекции риновирус, относительно здоровых элементов управления (рис. 5 d) (рис. 5 Перепечатано с разрешения ⁶).

Эти представительные результаты были получены из образцов этого eluted используя assay буфер, содержащий Tween-20 и 1% BSA 0,05% (см. Таблицу материалы).

Рисунок 1 : Быстрого поколения и распродажа простагландин-D2 после носовых Аллерген вызов. Уровень простагландина D2 (PGD2) измеряется от носовой поглощения элюаты последовательных выборок, после носовых Аллерген вызов с Тимоти пыльцы трав (n = 5). Каждая строка представляет данные из одного человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Кинетические измерения Ил-5 после носовых Аллерген вызов. Производство Ил-5 в серийный носовой поглощения образцов после носовых Аллерген вызов. Три повторить Аллерген задача исследования были проведены, с участниками (n = 19) получавших плацебо (синий), низкие дозы (10 мг) устный преднизон (оранжевый), или высоких доз (25 мг) устный преднизон (красный) один час до администрации аллерген. Линии обозначают геометрическое и погрешностей, 95% доверительных интервалов всех участников. (Рисунок печатается с разрешения от протечек et al., слизистой иммунологии, 2017). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Индукция интерферона гамма во время инфекции риновирус. Во время инфекции здоровых взрослых (n = 11, синий) и аллергических астматиков (n = 28, красный) с риновирус-16, носовые поглощения выборки был использован для измерения уровня интерферона гамма (ИФН γ). Данные представлены в виде A) сырые тонкие участки лиц и B) средний уровень с погрешностей, обозначающий межквартильный диапазон. (Рисунок печатается с разрешения от Hansel и др. ⁶). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Nasosorption дискриминирует повышенных интерферона γ, связанные с инфекцией RSV младенцев. Носовые поглощения и носоглотки аспирации (NPA) были использованы для измерения уровня интерферона гамма в грудных детей с бронхиолит, связанные с инфекцией респираторно-синцитиальный вирус (RSV) (красный, n = 12), не RSV дыхательных возбудителя (зеленый, n = 12) и здоровой элементы управления (синий, n = 9). Данные анализировали с помощью Kruskall-Уоллиса с данс коррекции для нескольких сравнений (***p< 0,001). Линии, обозначает медианные значения и погрешностей, межквартильный диапазон. (Рисунок изменен с разрешения Твэйтс et al. ³⁰). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Воспалительных медиаторов в бронхиальной поглощения образцов во время инфекции риновирус.
После инфицирования риновирус-16 здорового контроля (n = 10, синий) и аллергические астматические добровольцев (n = 23, красный), бронхиальной поглощения был использован для измерения уровня A) ИФН γ, Б) CXCL11, C) Ил-10 и Ил-5 D) на базовых и на 4 день инфекции. Данные анализируются Вилкоксон подписали Манна-Уитни и ранга испытания (образцов) (непревзойденные образцы). Рисунок печатается с разрешения от Hansel и др. ⁶ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Результаты от существующих методов выборки сократимость рассматриваются как весьма переменной; методы альтернативной выборки необходимо стандартизировать исследований в этой области⁵. NA и ба разрешение проб МЗФ неинвазивным способом и захватывающий потенциал для измерения иммунного ответа в здоровых и больных airways. Эти методы предлагают многочисленные потенциальные преимущества над существующими методами, включая большей переносимости, скорость выборки, способность часто повторять выборки, снизить изменчивость между пользователем и снизилась разрежения иммунных посредников⁵. Продолжительность поглощения и методика обработки следует быть оптимизированы для каждого исследования и строго поддерживать между события выборки. Кроме того в случае Ба, сайт выборки в дыхательные пути должны тщательно реплицируются между людьми.

NA и особенно Ба, являются по-прежнему относительно новых методов для клинических исследований. Однако преимущества этих методов привели к их использования в многочисленных исследованиях, в том числе тщательной проверки против альтернативных методов⁵. Эти устройства доступны теперь как маркировки CE устройства готовы для широкого использования в дыхательных путей исследования. NA и ба привести в гораздо меньших объемах выборки чем методы альтернативного выборки, полученные более высокие концентрации может привести к большей чувствительности для низкого залегания иммунной посредников.

В зависимости от желаемого нисходящие приложения NA и ба образцы могут быть непосредственно заморожены для более поздних обработки, повышение исследование осуществимости в среде клинических исследований. Протокол для обработки образца также могут быть адаптированы для конкретных нисходящие приложения. Предлагаемые обработки методы могут быть использованы для сбора белка или липидов иммунной посредников или нуклеиновых кислот, но должны быть оптимизированы для каждого исследования. В частности можно этого eluted МФ с различными буферами. Во-первых иммуноферментного анализа буфер может использоваться для измерения слизистой цитокины, chemokines и антитела⁶^,⁴⁵. Буферы с более высоким уровнем стиральный порошок также может использоваться для обеспечения что происходит лизис клеток, позволяя включение внутри клеточных цитокинов. Chaotropic РНК добыча буферы должны использоваться для определения вирусной инфекции, вирусные нагрузки, принимающих мРНК и микрофлора. В качестве альтернативы органических растворителей могут использоваться для lipidomics и масс-спектрометрии.

В заключение Прямая абсорбция МФ от слизистой поверхности это захватывающее техника с потенциального использования в дыхания, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой и других заболеваний слизистых оболочек. Однако эти перспективные методы поглощения потребует точную проверку выборки и обработки техника для отдельных анализов (биомаркеров) в каждой обстановке болезни. Кроме того эти методы Роман точности слизистой выборки потребует проверки против обычных образцов, таких как от крови, дыхание и мокроты. С помощью этих методов МФ может использоваться для измерения микробов, цитокины, chemokines, prostanoids и антител.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Финансирование: Эта работа была поддержана финансирование от Императорского Национальный институт для медицинских исследований (NIHR) центр биомедицинских исследований (BRC), NIHR здравоохранения защиты исследований подразделение (HPRU) в респираторные инфекции в Имперском колледже Лондона в партнерстве с общественного здравоохранения Англии (ПТО) и трансляционная исследовательский центр NIHR имперской безопасности пациентов. Мнения являются мнениями авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR, Департамент здравоохранения и общественного здравоохранения Англии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasosorption (adult, 7mm width)	Hunt Developments	NSFL-FXI-11	Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption	Hunt Developments	BSFL-FXI-11	Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane)	Sigma Aldrich	CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane)	Sigma Aldrich	CLS8160-24EA	For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer	Millipore	AB-33k	Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer	Life Technologies	FNN0021	Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction)	Qiagen	79216	Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich	302031-100ML-M	For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes	Costar	3213	2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best? Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).

Cite this Article

Thwaites, R. S., Jarvis, H. C.,… More

Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video

Medicine

Поглощение носовой и бронхиальной жидкостей: точность выборки человека слизистой оболочки дыхательных путей и лаборатория обработки образцов

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

PLAYLIST

Diagnostic Procedure

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

PLAYLIST Diagnostic Procedure

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

PLAYLIST

Diagnostic Procedure