Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bloedplaatjes productie komt voornamelijk in het beenmerg in een proces dat bekend staat als thrombopoiesis. Tijdens thrombopoiesis onderscheid hematopoïetische voorlopercellen naar vorm bloedplaatjes precursoren genaamd megakaryocytes, die terminaal differentiëren om bloedplaatjes van lang cytoplasmatische processen genoemd proplatelets vrij te geven. Megakaryocytes zijn zeldzame cellen beperkt tot het beenmerg en zijn daarom moeilijk om te oogsten in voldoende aantallen voor laboratoriumgebruik. Efficiënte productie van menselijke megakaryocytes kan worden bereikt in vitro door het kweken van CD34+ cellen onder adequate omstandigheden. Het protocol hier gedetailleerde beschrijving Isolatievan CD34+ cellen door magnetische cel sorteren van bloedmonsters van de navelstreng. De nodige maatregelen om het produceren van zeer zuivere, volwassen megakaryocytes onder serumvrij voorwaarden worden beschreven. Details van fenotypische analyse van differentiatie van de Megakaryocyt en bepaling van de proplatelet formatie en bloedplaatjes productie zijn ook aanwezig. Effectoren die van invloed zijn Megakaryocyt differentiatie en/of de vorming van de proplatelet, zoals anti-bloedplaatjes antilichamen of thrombopoietin mimetics, kunnen worden toegevoegd aan gekweekte cellen te bestuderen van de biologische functie.
Inleiding
Isolatie van een voldoende aantal primaire menselijke megakaryocytes (MK) voor regelmatige laboratoriumgebruik is niet haalbaar vanwege hun lage frequentie in het beenmerg, waar ze goed voor ~0.01% voor genucleëerde cellen1. Een handig alternatief is de ex vivo uitbreiding en differentiatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen in de aanwezigheid van bepaalde groeifactoren. Een aantal cytokines waaronder stamcel factor (SCF; c-kit ligand) en Interleukine (IL) -3 en IL-11 geweest is werkzaam in cultuur systemen te produceren MKs. Thrombopoietin (TPO) de meest effectieve groei en differentiatie factor voor megakaryocytic cul....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de zuid-oostelijke Sydney menselijke ethiek Commissie onderzoek en door de Commissie van de ethiek van het onderzoek van de Universiteit van New South Wales het menselijke geratificeerd. Navelstrengbloed verkregen van gezonde donoren werd verstrekt door de Sydney navelstrengbloed Bank (Sydney, NSW, Australië). Volumes van ongeveer 100 mL werden gebruikt voor deze procedure.
Let op: Brei in een klasse II bioveiligheid kabinet met behulp van aseptische techniek. Ontsmetten van de buitenkant van de koord bloed zak met 70% ethanol. Steriele instrumenten (schaar, pincet) gebruik voor deze procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol staat toe de voorbereiding van zeer MK reinculturen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Het percentage van de CD34+ cellen in koord bloed is ongeveer 1,3%15 (figuur 1A) en het totale aantal mononucleaire cellen (stap 1.8) varieert van 90-300 x 106 per UCB eenheid. De zuiverheid van CD34 +/ CD45 + cellen na isolatie varieert van 90 tot 99% (figuur 1B). MK (.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol hier beschreven is geschikt voor de constante productie van MK en bloedplaatjes in de cultuur van navelstrengbloed. Deze cellen kunnen worden gebruikt om verschillende processen zoals het effect van geneesmiddelen of biologische activiteiten op MK proliferatie, differentiatie, proplatelet formatie en bloedplaatjes productie te bestuderen.
Een verscheidenheid van cultuurmedia en cytokine combinaties zijn aangebracht in de literatuur. Toevoeging van cytokinen zoals stamcel factor, F.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de steun van de Australische Health and Medical Research Council (project subsidie 1012409 gekoppeld aan BHC).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-vrij media voor CD34+ cellen |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| CD34 Isolatiereiagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapuur | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | Deze kit bevat de FcR humane IgG blokkeringsreagens en CD34 microbeads. Deze kralen bevatten het anti-CD34 antilichaam klonen QBEND/10. Gebruik een ander anti-CD34 klonen voor zuiverheidscontrole (bijv. klon 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymfocyt scheidingsmedium (dichtheid 1.077 g/mL) |
| Steriele scheidingsbuffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | Deze buffer bevat fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.2 bevattend 0,5% bovijn serumalbumine en 2 mM EDTA. Het kan worden bereid met steriele, celkweekkwaliteitscomponenten. Ontgas voor gebruik omdat luchtbellen de kolom kunnen blokkeren. |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Flow Cytometrie en Celkleuring Reagents | |||
| PE Muis anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Klon 8G12. Dit kan worden gebruikt voor CD34 zuiverheidscontrole. Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning. |
| PerCP muis anti-mens CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 verdunning |
| PerCP isotype controle | BD Biosciences | 349044 | 1:10 verdunning |
| FITC Muis anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Eind antilichaam concentratie 1:5 verdunning. |
| APC Muis anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | Dit antilichaam kan ook worden gebruikt om volwassen MK te detecteren (het percentage van de positieve cellen is meestal lager dan met anti CD42a). Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning. |
| Alexa Fluor 647 Muis anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Momenteel gedistribueerd door Bio-Rad. Eind antilichaam concentratie 1:10 verdunning. |
| Alexa Fluor 647 Muis Negatieve Controle | AbD Serotec | MCA928A647 | Momenteel gedistribueerd door Bio-Rad. Isotype controle antilichaam |
| Anti von Willebrand factor konijn polyklonaal | Abcam | AB6994 | 1:200 verdunning |
| V450 muis anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 verdunning |
| V450 isotype controle | BD Biosciences | 580373 | 1:20 verdunning |
| PAC1-FITC antilichaam | BD Biosciences | 340507 | 1:10 verdunning |
| Anti CD62p muis monoklonaal | Abcam | AB6632 | 1:200 verdunning |
| Alexa Fluor 488 geit anti konijn IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 verdunning |
| Alexa Fluor 594 geit anti muis IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 verdunning |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype controle antilichaam |
| Propidiumjodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Tellingkralen |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Materiaal | |||
| LS kolommen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Kleinere en grotere kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar |
| MidiMACS Separator magneet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL ronde bodem polypropyleen FACS buizen, met Snap Cap, sterieel | In Vitro technologieën | 352063 | |
| Glazen dia's | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Bevestigingsmedium met DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade bevestigingsmedium met DAPI |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| Omgekeerd microscoop | Leica | DMIRB omgekeerde microscoop | |
| Fluorescentiemicroscoop | Zeiss | Vert.A1 | |
| Celanalysator | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Software | |||
| Celanalysator software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analyse software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescentiemicroscoop software | Zeiss | Zen 2 blauwe editie |
Referenties
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
