В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.
Введение
Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад1и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина2. Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы3,4,5,6 . ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. цветок и стручок фиксации
- На открытии первого цветка синхронизации урожай цветы и siliques из растений.
Примечание: В экспериментальных условиях использовали здесь, растения начинают цветение около 21 дней после пересадки от плиты фотосинтетическую и Скуг (МС) в почву. Семена, стратифицированная по 3 – 4 дня при температуре 4 ° C и проросшие/выращенных на MS пластинки в свет 16 h/22 ° C и 18 ° C/8 h темный для 8-10 дней, до высадки рассаду на богатые питательными веществами почвы в горшках, хранится на тех же условиях (рис. 1). Количество реплицирует зависит от цели конкретных исследований, но минимум 5 соцветия (от 5 отде....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Арабидопсис принадлежит к семейству Brassicacea, принимая соцветия цветками бисексуалов, организовал в цветет (рис. 1). Каждый цветок имеет четыре чашелистика, четырьмя лепестками, шесть тычинок (четыре длинный и два коротких) и синкарпная гинецея, состоящий из двух врожденно плавленого плодолистиков (Рисунок 1F-H) расположены в четырех концентрических мутовках25,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хорошей отправной точкой между различными отдельных растений является открытие первый цветок основных соцветий. Растения обрабатываются таким образом, что цветение синхронизированы как возможно (например, 3 – 4 дня, расслоение на.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана университета Цюриха, МЭФ Мари Кюри Грант (Грант нет. TransEpigen-254797 года хиджры), расширенный грант Европейского исследовательского совета (Грант нет. Medea-250358 уг) и исследования и разработки технологий проект (Грант MecanX уг) от SystemsX.ch, швейцарская инициатива по биологии систем.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>реагенты и материалы | |||
| этанол | Шарлау | ET00102500 | |
| уксусной кислотой | Апплименем | A3686,2500 | 100% Молекулярная биология Ледяная |
| уксусная кислота | Сигма-Олдрич | 320099 | Молекулярная биология |
| Метанол | Шарлау | ME03062500 | |
| Раствор формальдегида | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Пропионовая кислота | Sigma-Aldrich | 81910-250 мл | |
| Гидрат хлорала | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Глицерин | Roth | 3783.1 | |
| Гуммиарабик | Fluka | 51198 | |
| Молочная кислота | Fluka | 69773 | |
| Фенол | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | Мы использовали жидкий фенол (используйте плотность, чтобы найти необходимый объем для вашего раствора) |
| Гвоздичное масло | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Йод | Fluka | 57665 | |
| Йодид калия | Merck | 5043 | |
| Малахитовый зеленый | Fluka | 63160 | |
| Фуксиновая кислота | Fluka | 84600 | |
| Оранжевый G | Sigma | 7252 | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | L3771 | Молекулярная биология Класс |
| гидроксида натрия | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Дигидрофосфат | натрия Applichem | A1047,1000 | |
| Двухосновной фосфат натрия | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Фосфат калия | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Флуоресцентный отбеливатель 28 |
| Аурамин | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | токсичный |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Анилиновый синий | Merck | 1275 | |
| MS средний | Каролина | 19-57030 | |
| Богатый питательными веществами субстрат | Einheitserde | ED73 | |
| Стекло | Без определенной марки | ||
| Сокол центрифуга пробирки 15 мл | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Щипцы | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Щипцы | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Шприц | BD | BD Plastipak 300013 | 1 мл |
| Игла для подготовки | BD | BD Microlance 304000 | |
| Предметные стекла для микроскопа | Thermo Scientific | 10143562CE | обрезка |
| кромок Покровные стекла | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Влажный ящик | Пластиковый ящик с влажным бумажным полотенцем и скользящими опорами внутри | ||
| Название | Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| Solutions< | |||
| >Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) | Абсолютный этанол: ледяная уксусная кислота, 3:1 (мл:мл)Фиксатор | ||
| метанол/уксусная кислота | 50 % (v/v) метанол, 10 % (v/v) ледяная уксусная кислота в деионизированной воде | ||
| фиксатор | Формалин, пропионовая кислота, 50% этанол; 5:5:90 (мл:мл:мл) | ||
| <сильно>Очищающие растворы | |||
| Хлорал гидрат/глицерин | Хлорал гидрат : глицерин : вода, 8:1:2 (г:мл:мл). Может использоваться на всех стадиях развития цветка и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является формалин на основе FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7,5 г, хлорал гидрат 100 г, глицерин 5 мл, вода 30 мл. Может использоваться на всех стадиях развития цветка и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является формалиновая основа FPA50 | ||
| Herr's 4½ очищающая жидкость | молочная кислота, хлоралгидрат, кристаллы фенола, гвоздичное масло, ксилол; 2:2:2:1, по весу. Может использоваться на всех стадиях развития цветка (особенно для развития тычинок) и для силиконного развития с помощью DIC-микроскопии. Лучшим фиксатором является раствор | ||
| SDS/NaOH | Разбавьте SDS и стоковый раствор NaOH до 1% SDS / 0,2 N NaOH (10-кратное разведение). Для всех стадий развития цветка и силика. Лучшим фиксатором является фиксатор метано/уксусной кислоты; Также можно использовать два других фиксатора. Можно комбинировать с калькофтором, аурамином, DAPI и раствором для окрашивания анилинового синего. | ||
| Исходный раствор | 10 % (w/v) додецилсульфата натрия. Растворите 10 г додецилсульфата натрия в 80 мл деионизированной воды и сделайте до 100 мл с деионизированной водой. | ||
| Стоковый раствор | 2 Н раствор NaOH: 4 г NaOH растворить в 40 мл деионизированной воды и сделать до 100 мл с деионизированной водой | ||
| <сильно>Комбинированные очищающие и окрашивающие растворы | |||
| Herr's IKI-4½ | К стандартному 4½ (всего 9 г) Добавить: 100 мг йода, 500 мг йодида калия. Это очищающее решение может быть использовано для всех стадий развития цветка и для силикового развития, как для повышения контрастности, так и для характеристики динамики крахмала. Используйте FPA50 для структурного анализа и фиксатор Карноя для количественного анализа крахмала. | ||
| Окрашивание Александра | зеленый (1% в 95% EtOH) 1 мл, фуксиновая кислота (1% в ddH2O) 5 мл, апельсин G (1% в ddH2O) 0,5 мл, фенол 5 г, хлорал гидрат 5 г, ледяная уксусная кислота 2 мл, глицерин 25 мл . Это очищение/окрашивание отдельно или в сочетании с Herr's 4½ Раствор может быть использован для оценки аборта пыльцы у цветков со зрелыми и трехклеточными пыльцевыми зернами. Он используется на свежезаточенном незакрепленном материале. | ||
| <сильно>Окрашивающие растворы | |||
| Раствор калькофтора | 0,007% в воде (г:мл). Первоначально использовался в качестве оптического осветлителя. Может использоваться для окрашивания целлюлозы, карбоксилированных полисахаридов и каллозы в клеточных стенках. Часто используется для окрашивания внутренней части пыльцевого зерна. С этим раствором можно использовать все три фиксатора. | ||
| Раствор | аурамина Аурамин 0,01% в воде (г:мл). Этот липофильный флуоресцентный краситель можно использовать для окрашивания кутикулы, кутина и экзина. С этим раствором можно использовать все три фиксатора | ||
| Калькофтор-аураминовая смесь | Раствор аурамина: Раствор Калькофтор, 3:1. Может использоваться для комбинированного окрашивания обоими растворами. Другие пропорции могут быть проанализированы с сохранением меньшей доли калькофтора по отношению к аурамину. | ||
| DAPI раствор | DAPI 0,4 мкг/мл, 0,1 М натрия фосфатный буфер (pH 7), 0,1% Triton-X-100, 1 мМ ЭДТА. Этот раствор можно использовать для окрашивания хромосомных разбросов во время мужского и женского мейоза, а также ядра клеток любых тканей. Часто используется для изучения развития пыльцевых зерен. Карной и метанол/уксусная кислота являются лучшими фиксаторами для этого решения. Фиксаторы на основе формальдегида, такие как FPA50, могут препятствовать окрашиванию. Возбуждение в ультрафиолетовом диапазоне и максимальное излучение около 461 нм. | ||
| Натрий-фосфатный буфер (0,1 М) | Протонный рецептор: 0,2 М Na2HPO4, донор протона: 0,2 М NaH2PO4, соотношение протонный донор / протонный рецептор: 1,364 ( для pH 7) | ||
| Анилиновый синий раствор | 0,1% (w/v) анилиновый синий, 108 мМ K3PO4 (pH 11), 2% глицерин. Этот раствор можно использовать для окрашивания каллозы и целлюлозы на многих стадиях развития (например, отложение каллозы в мужских и женских терадах, каллозные пробки в пыльцевых пробирках). Возбуждение в ультрафиоле и максимальное излучение около 455. Он также может возбуждаться на длине волны 514 нм с излучением в красном цвете для окрашивания содержимого клеток. |
Ссылки
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
