추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법
Summary
선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.
Abstract
추출 및 생물 학적 체액에서 카 테 콜 아민 신경 전달 물질의 분석은 신 경계 기능 및 관련된 질환 평가에 매우 중요 하지만 그들의 정확한 측정은 여전히 도전 이다. 많은 프로토콜 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함 하 여 악기의 다양 한 신경 전달 물질 측정에 대 한 설명 했습니다. 그러나, 단점, 복잡 한 작업 또는 감지 하드는 피할 수 없는 여러 대상 이며 현재, 지배적인 분석 기술은 여전히 HPLC로 인해 민감한 전기 또는 fluorimetric 탐지와 결합 그것의 높은 감도 그리고 좋은 선택입니다. 여기, 상세한 프로토콜에서에서 설명 하는 전처리 및 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD) 고압 액체 크로마토그래피와 catecholamines의 검출을 위한 electrospun 복합 nanofibers 구성을 사용 하 여 유아의 실제 소변 샘플 폴리스 티 렌으로 adsorbent와 고분자 크라운 에테르의 포장 섬유 고체 상 추출 (PFSPE) 메서드 라고도합니다. 우리는 소변 샘플을 쉽게 nanofiber 포장 단단한 단계의 열을 어떻게 샘플에서 analytes는 빠르게 농축 될 수 있다, precleaned 수 있습니다 desorbed, 방법과 ECD 시스템에서 발견을 보여줍니다. PFSPE 감소 시간, 비용, 목표의 손실의 감소에 대 한 수 있도록 생물 학적 샘플에 대 한 전처리 절차를 크게 간소화 합니다.
전반적으로,이 작품에서는 세 monoamine 신경 전달 물질 (노르 (NE), (E) 피 네 프 린, 도파민 (DA))의 동시 결정 하 고 두 개의 HPLC ECD 시스템에 결합 하는 고체 상 추출에 대 한 간단 하 고 편리한 프로토콜 그들의 대사 산물 (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) 및 3, 4-dihydroxy-phenylacetic 산 (DOPAC)) 유아의 소변에서. 설립된 프로토콜 요도 catecholamines의 차이 주 뇌 손상 위험이 높은 유아와 건강 한 컨트롤 사이의 그들의 대사 산물을 평가 하기 위해 적용 되었습니다. 비교 분석으로 카 테 콜 아민 대사 산물의 경우 유아의 뇌 손상에 대 한 위험이 조기 진단 위한 중요 한 후보 마커를 있을 수 있습니다 나타내는 두 그룹 사이의 요도 MHPG에 상당한 차이가 나타났다.
Introduction
카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 체액에 그들의 대사 산물 내용을 신경 기능에 영향을 하 고 대부분1에 응답 자극의 균형에 영향을 미칠 수 있습니다. Abnormities는 pheochromacytoma, ganglioneuroma, 신경, 신경 성 질환1,2등 질병의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 추출 및 체액에서 catecholamines에의 결정은 관련 질병의 진단에 의미가 있습니다. 그러나, catecholamines 생물 학적 샘플에 낮은 농도에서 존재 하 고 쉽게 산화 된다. 또한, 그들은 매우 많은 양의 중간3에서 간섭 때문에 elute 어렵다입니다. 따라서, catecholamines 생물 학적 체액에서의 동시 검출은 여전히 도전.
리뷰 요 catecholamines 스트레스, 측정 될 수 있습니다 그리고 그들의 수준은 신생아5처리 촉각 자극에 응답 하는 중요 한 생물 학적 마커 표시 되었습니다. 연구에 따르면 조 사건에서 고통을 모든 유아 뇌 부상4,,56에 대 한 위험이 있으며 부상 catecholamines 비정상적인 릴리스 체액에 관련된 문제를 발생할 수 있습니다. 고급 자기 공명 기술을 이전 단계7,8뇌 손상을 감지할 수 있는 존재 한다. 그러나, 첫 번째 48 h 내 비정상적인 neurodevelopmental 과정 하면 영구적인 뇌 손상 의료 이미지11분명 되지 않습니다. 게다가, 높은 비용 및 부족 한 악기 자원을 다른 요인 함께 인해 이러한 전문된 신경 이미징 기법에 대 한 액세스를 모든 신생아 단위에 대 한 없습니다. 그러나, (예: catecholamines 및 그들의 대사 산물) 쉽게 친근 하 고 실용적인 바이오 마커를 사용 하 여 이러한 단점을 극복할 수 고 인간의 체액에 바이오 마커 검사 수 있습니다 뇌 손상의 조기 진단에 도움이 프롬프트 이어질 신생 유아 neuroprotection9필요의 식별. 소변에서 catecholamines 체액 및 neuroactivity 기능으로 그들의 양 사이의 직접적인 상관 관계 때문에 간단 하 고 명백한 인덱스 수 있습니다.
생물 학적 체액 중 뇌 척추 액체 (CSF) 및 플라즈마 샘플 쉽지 않은 기존 외상 성 절차를 통해 얻을 수 그리고 그것은 또한 매우 어려운 접착 단백질 및 기타 불순물, 선도 하는 귀찮은 간섭 제거 하 고 시간이 걸리는 샘플링 과정 반복된 탐지를 위한 적합 하지 않습니다. 또한, 어린이 위한 아니다 거의 충격적인 패션에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 따라서, 요 샘플링은 샘플링의 다른 형태의 보다 더 나은 그것은 비 침략 적, 간편한 작동, 그리고 반복 해 서 행 해질 수 있다. 소변 샘플은 풍부 하 고 쉽게 저장 하 고, 큰 이점이 생물 샘플의 다른 형태의 표시.
생물 학적 체액에 catecholamines 척도를 주요 방법 등 radioenzymic 분석 실험10, 면역 매 분석 실험 효소 연결 된11, voltammetry12 열 렌즈 분석13. 하지만 단점이 존재, 복잡 한 작업 등 및 감지 하드 여러 대상을. 오늘, 지배적인 분석 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)14, 그것의 높은 감도 및 좋은 선택 때문에 민감한 전기15 또는 fluorimetric 검출16와 결합 이다. 같은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 기술로 질량 분석 (LC/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석/질량 분석 (LC/MS/MS), 분석 및 정량화는 신경 전달 물질의 높은 얻을 수 있습니다 / 정확성과 특이성17,18. 그러나, MS 기술 비싼 계측 뿐만 아니라 대부분의 기존 실험실에서 보편적으로 적용 하는 방법 어렵게 실질적으로 자격 갖춘된 인력을 필요 합니다. ECD HPLC 시스템은 일반적으로 가장 전통과 임상 실험실에 있고 따라서 연구 그룹 화학 결정에 대 한 사용을 위한 일반적이 고 좋은 선택 되고있다 하지만 그들은 샘플의 청결을 시스템에 도입 해야 미 양19. 따라서, 정화 하 고 분석 하기 전에 샘플을 응축에 매우 중요 하다. 정화 단계에 대 한 고전적인 방법 이며 액체-액체 추출14,,1520 오프 라인 고체 상 추출, 활성된 알 루미나 열21,22 포함 하 여 및 diphenylborate (DPBA) complexation23,,2425,26.
명 리 외. 사용 하고있다 폴리머 수 지는 화학적으로 흡착 제는으로 크라운 에테르로 수정 인간의 소변에서 200727이후 catecholamines을 선택적으로 추출. 또한, 2006 년에, Haibo 그 외. 보여주는 boronate 선호도 추출 매 byutilizing에 대 한 손쉬운 종합 접근 functionalizable nanomagnetic 다면체 oligomeric silsesquioxane (포스) 기반된 nanomagnetic 합성, catecholamines에의 농축에 적용 인간의 소변 (더욱, 피 네 프 린 및 isoprenaline)28. 그들은 또한 나노 전기 불리고는 nanoscale 중합체 섬유 물자 형성 기술을 사용 하 여 작업을 수행 하기 위해 나노 소재 활용을 했다. 전기 프로세스는 작동 전압을 제어 하 고 다른 매개 변수29는 회전 솔루션의 내용을 변경 하 여 직경, 형태, 그리고 제품의 공간 맞춤을 조정할 수 있습니다. 기존 SPE 카트리지 비교, electrospun nanofibers는 추출 하 고 복잡 한 매트릭스에서 대상 analytes 풍부 매우 적합 한 그들은 높은 효율으로는 analytes를 adsorb 높은 표면 지역에 양 비율을 갖추고 있습니다 그리고 더 쉽게 제어 표면 화학 속성을 대상 화합물의 편리한 부착을 전시 한다. 이러한 속성을 있도록 SPE adsorbents, 크게 고체 단계와 탈 착 용 금액30,31,,3233감소에 대 한 좋은 선택. 소변 샘플에서 catecholamines에 대 한 electrospun nanofibers 폴리스 티 렌 (PCE-PS)와 apolymeric 크라운 에테르의 구성 3 catecholamines (네브라스카, E, 및 다)34를 선택적으로 추출 하 사용 되었다. 종이 선택적 크라운 에테르 흡착 네브라스카, E, 및 다, catecholamines 수소 결합을 형성을 통해 바인딩하는 정확한 기하학을 기반으로 했다 어떤의 대상 표시. 결과 표시 소재 크라운 에테르 효과적으로, 생물 학적 샘플에 포함 된 다른 간섭 화합물을 제거. 이 보고서에 의해 영감, 새로운 메서드는 catecholamines의 선택적 추출에 의해 개발 되었다 electrospun 복합 nanofibers PCE 추 구성의 사용
이 문서에 메서드를 보고 이전34 개선 되었고 성공적으로 E, 네브라스카, 고 다, 뿐만 아니라 그들의 대사 산물, MHPG 및 DOPAC, 소변에서 분석 뿐만 아니라 고용. 우리는 또한 흡착 과정의 메커니즘에 대 한 새로운 가능성을 탐험. 메서드 표시 만족 추출 효율과 5 analytes에 대 한 선택도 하 고 메서드가 perinatal 뇌 손상와 건강 한 컨트롤 위험이 높은 유아에서 소변의 분석에서 검증 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에 제안 된 PFSPE 메서드는 중요 하 고 그것의 신속성, 단순성, 및 편의 의미 있을 수 있습니다. Adsorbents 프로토콜에 사용 되는 electrospun nanofibers, 높은 표면 영역 볼륨 비율, 있고 높은 효율으로는 analytes를 흡착 한. 절차만 nanofiber의 몇 밀리 그램 및 eluant 용 매, 작은 볼륨을 필요로 하 고는 analytes을 집중 하는 증발 단계를 필요 하지 않습니다. 여기, 우리 설정 검색에 대 한 효과적인 방법에 새 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (No.81172720, No. 81673230), 사회 개발 연구 프로그램의 장쑤 성 과학 및 기술 부 (제에 의해 지원 되었다 BE2016741), 과학 및 중국의 질 감독, 검사 및 검역 (2015QK055), 아동 발달 및 교육 과학기술부의 과학 학습의 주요 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 일반 관리의 기술 프로젝트 남동 대학 (CDLS-2016-04). 우리는 진심으 원 노래와 Ping Liu 샘플 컬렉션에 우리 지원 인정 합니다.
Materials
| 200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
| PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
| steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
| gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
| methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
| diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
| norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
| 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
| epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
| 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
| dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
| 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
| phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
| uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
| creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
| trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
| KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
| C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
| NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
| urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
| NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
| MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
| HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
| citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
| EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
| monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
| 1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
| sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
| phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
| Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
| SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
| SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
| SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
| ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |
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