Utvärdera In Vitro DNA-skador med komet-analys
Summary
Komet analysen är en effektiv metod att upptäcka DNA-skador inklusive enkel- och dubbel-strängat DNA bryter. Vi beskriver basiska och neutrala komet analyser för att mäta DNA-skador i cancerceller att utvärdera den terapeutiska effekten av kemoterapi.
Abstract
DNA-skador är ett vanligt fenomen för varje cell under dess livslängd och definieras som en förändring av den kemiska strukturen hos genomiskt DNA. Cancerbehandlingar, såsom radio- och kemoterapi, införa enorm mängd ytterligare DNA-skador, vilket leder till cellcykelarrest och apoptos att begränsa cancer progression. Kvantitativ bedömning av DNA-skador under experimentell cancerterapi är ett viktigt steg att motivera effektiviteten av en genotoxisk agent. I denna studie, vi fokuserar på en enda cell elektrofores analys, även känd som komet analysen, som kan kvantifiera enda och dubbel-strand DNA avbrott in vitro. Komet analysen är en DNA skador kvantifiering metod som är effektiv och lätt att utföra, och har låga tid/budget krav och hög reproducerbarhet. Här, belysa vi nyttan av komet analysen för en preklinisk studie genom att utvärdera genotoxiska effekten av olaparib/temozolomide kombinationsbehandling till U251 glioma celler.
Introduction
Komet analysen utvecklades först av Östling och Johanson 1984 genom att påvisa migration av DNA fragment från atomkärnor under en neutral villkor1. Tekniken utvecklades senare av Singh et al., visar att ett alkaliskt tillstånd ökade väsentligt den specificitet och reproducerbarhet av assay2. Sedan dess har neutral komet analysen mestadels används för att upptäcka dubbelsträngat DNA raster, medan den alkaliska komet-analysen är mer känsliga för mindre mängder DNA-skador, inklusive enkelrum och Dubbelrum strand DNA bryts, alkali-labila platser, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking och DNA single-strand raster är associerad med ofullständig excision reparation platser3,4. Båda analyserna ge visualisering av fragmenterade DNA och tillhandahålla ett okomplicerat sätt att utvärdera kvantitativt DNA-skador. Komet analysen betraktas som en känslig metod för in vitro och i vivo genetiska toxikologiska studier och är tillämplig på olika forskningsområden, som tidigt läkemedelskandidat urval, miljöövervakning, biologisk övervakning, och grundläggande forskning om DNA-skador och reparation5.
Principen om analysen är att under ett elektriskt fält, fragmenterade DNA migrerar ut ur nucleoid kroppen (även känd som ”komet huvudet”) och bildar en DNA fläck i agarosgel (även känd som ”komet tail”). Med nukleotid färgning, kan omfattningen av DNA-skador kvantifieras genom att analysera ”kometer” bildas av denna enda cell elektrofores. Beräkning av svansen nu kan ytterligare bidra till att jämföra DNA-skador bland olika experimentella grupper. Komet analysen jämfört med traditionella metoder av DNA skada upptäckt, och är direkt, känslig, billig och relativt enkel.
Strålbehandling och kemoterapi är gemensamma strategier för cancerbehandling genom att generera enda strand och dubbel strand DNA bryter i kromosomer6. Senaste befordran i DNA reparation hämmare tillåter en effektivare genotoxisk effekt genom kombinationskemoterapi, och därför minskar potentiellt systemiska biverkningar såsom anemi, infektion och benmärgen dämpning7, 8. i denna studie visade vi utredningen av en poly (ADP-ribos) (PARP) polymerashämmare, olaparib (Ola)9. PARP är en riklig nukleära protein och ansvarar för DNA base excision repair genom att bilda en poly (ADP-ribos) polymer10. Temozolomide (TMZ) är en oralt tillgänglig alkylerare och har använts för gliom patientbehandling. Genom att använda komet analysen för att kvantifiera DNA-skador, visar vi att kombinera olaparib med temozolomid djupt förbättrar de DNA-skador i glioma celler, vilket tyder på olaparib/temozolomide kombinationsbehandling är en effektiv strategi att behandla gliom, som jämfört med temozolomid ensam11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Komet analysen är ett effektivt verktyg att mäta enkel- och dubbel-strand DNA raster på cellnivå. Analysen har tillämpats allmänt som ”golden standard” i studier avseende gentoxicitet och biologisk övervakning13, alltifrån bas lesioner, DNA antipyridinantikropp, läkemedelsutveckling och alkali känsliga platser. I den aktuella studien visade vi två distinkta stegvisa protokoll för basiska och neutrala komet analyser, respektive. Kombinera enstaka cell elektrofores, fluorescerande mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet NIH, NCI och CCR. Alla författare fick intramurala forskningsbidrag från NIH, NCI och CCR.
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?. Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O’Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
