Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Resumen

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)_180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Resumen

Neuritis autoinmune experimental (EAN) es un bien apreciado modelo experimental de enfermedades desmielinizantes periféricas autoinmunes. Enfermedad EAN es inducida por inmunizar a ratones con péptidos neurogénicas para dirigir un ataque inflamatorio hacia los componentes del sistema nervioso periférico (PNS). Los avances recientes han permitido la inducción de la EAN en la línea de ratón C57BL/6 relativamente resistente utilizando mielina proteína cero (P0)_106-125 o P0_180-199 péptidos entregados en adyuvante combinada con la inyección de la Toxina pertussis. La capacidad de inducir la EAN en la cepa C57BL/6 permite el uso de las herramientas genéticas numerosos que existen en este fondo de ratón y permite así el sofisticado estudio de patogénesis de la enfermedad y el interrogatorio de la acción mecanicista de la nueva terapéutica en combinación con los enfoques de transgénicos. En este estudio, demostramos un enfoque simple para inducir con éxito EAN con el péptido de_180-199 P0 en ratones C57BL/6. También describiremos un protocolo para la evaluación de los déficits funcionales que se producen en este modelo, acompañado por una serie de características de neuropathological. Así, este modelo es un potente modelo experimental para estudiar la patogenesia de neuropatías desmielinizantes periféricas humanas y determinar la eficacia de terapias potenciales que pretenden promover la reparación de la mielina y proteger contra el daño del nervio en autoinmune neuritis.

Introducción

Neuropatías periféricas pueden ser genéticas en origen o adquirida, con neuropatías adquiridas teniendo ya sea metabólica, isquémico, precipitados inflamatorios o tóxicos. Estas enfermedades se clasifican también provechosamente como axonal o demyelinative en origen. El más común adquirida desmielinizante Neuropatías periféricas son la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP, también conocido como síndrome de Guillain-Barré, SGB) e inflamatoria desmielinizante polineuropatía crónica (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; ambos pathogenetically ....

Protocolo

todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Instituto de Florey de Neurociencia y Salud Mental (centro del cerebro de Melbourne) Comité de ética Animal y seguir el código australiano de prácticas para el uso de animales para la ciencia Efectos.

1. inducción de EAN

Nota: EAN puede ser inducida con éxito en ratones C57BL/6 machos de edades comprendidas entre 6-8 semanas. El protocolo de inducción lleva 9 días en total. Día 0 se refiere al día de la primera vacunación. De este protocolo, las inyecciones se realizaron bajo anestesia (ver paso siguiente 1.1.2).

1. En el día -1:

Resultados

P0_180-199 péptido inducido EAN en plomos de ratones C57BL/6 a una enfermedad monofásica con puntuación clínica inicio de post 6 días primera inmunización (PPP) y la máxima puntuación severidad se observa desde dpi 25 seguido de un score clínico mejora de 40 dpi duración (figura 1)^4,9. En cuanto a la función de la marcha, ratones empiezan a fracasar en una tarea simple de ejecución tan pront.......

Discusión

Este informe describe un método sencillo para inducir EAN con el péptido de_180-199 P0 en ratones C57BL/6, lo que permite la cuantificación de los déficits neuropathological y funcionales claves en ratones inducidos con EAN. Distinto en el protocolo de inducción de EAN se describe aquí es el uso de anestesia mientras se realizan las inyecciones de inmunización. El uso de la anestesia isoflurano mejora en gran medida la capacidad para garantizar que el volumen total de inóculo se inyecta por vía subcutánea en el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C57BL/6, macho, 6-8 semanas de edad	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
toxinas para la tos ferina	Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M Solución salina tamponada con fosfatado isotónico de ratón (MT-PBS)			Los laboratorios tendrán su propio protocolo.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories tendrá su propio protocolo de administración.
P0180– 199 péptido	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180– 199, secuencia S– S– K– R– G– R– Q– T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S
Mycobacterium tuberculosis (cepa H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Adyuvante completo de Freund (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehído (PFA)	Servicios de Microscopía Electrónica	#15710	Diluido a 4% PFA día de recolección de tejidos.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Diluir a 2.5% glutaraldehído día de fijación.
Azida de sodio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Cree un 10% (c/v) de stock en 0,1M MT-PBS. Úselo al 0,03% (v/v).
Sacarosa	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Uso al 30% (p/v).
Temperatura óptima de corte (OCT) media	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Suero de burro normal	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Uso como diluyente de anticuerpos al 10% (v/v) u otra concentración determinada por el propio laboratorio.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Uso en diluyente de anticuerpos al 0,3% (v/v) u otra concentración determinada por el propio laboratorio.
proteína precursora antiamiloide de conejo (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, EE. UU	S12700	Utilizado a 1:400 o valorado en laboratorio propio.
proteína 1 asociada a anti-contactina de conejo (Caspr)	Regalo del Prof. Elior Peles, Instituto Wiezmann de Ciencias, Israel		Utilizado a 1:500 o valorado en el propio laboratorio.
Anticuerpos secundarios conjugados apropiados Alexa Fluor	Sondas moleculares (Life Technologies), O, EE. UU	Varios	Uso a 1:200 o titulación en laboratorio propio. La elección de la especie en la que se crió el anticuerpo y la elección de Alexa Fluor queda a discreción de cada laboratorio.
Solución de montaje acuoso	Dako (Agilent), CA, USA		Cada laboratorio tendrá su propia preferencia.
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Equipo
0.5 mL jeringa con agujas de 301/2	g BD	#326105
agujas de 23 g	BD#	305143
Almohadilla de tinta roja Cualquier almohadilla			tinta roja o colorante alimentario rojo podría usarse para marcar las patas de los animales.
Aparato DigiGate (incluye cinta de correr)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Sistema de imágenes DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Cronómetro			Se puede utilizar cualquier temporizador.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscopio de disección	Zeiss		Se puede utilizar cualquier microscopio de disección adecuado.
Portaobjetos cargados	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Se puede utilizar cualquier cyrostat adecuado.
Equipos de perfusión e instrumentos			Los laboratorios contarán con sus propios protoctotles de perfusión.
Cámara humificada			Los laboratorios pueden producir la suya propia utilizando un recipiente de plástico opaco.
	El lápiz		cera o la tensión superficial también se pueden usar para crear un pocillo alrededor de la sección de tejido.
Microscopio confocal	Zeis LSM780		Se puede utilizar cualquier microscopio confocal con líneas láser adecuadas.
FIJI/Image J	Institutos Nacionales de Salud		Disponible en www.fiji.sc

Lista de. . #S3023 de de disección opaca de