Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi
Summary
Macrophage ekstracellulære feller er en nylig beskrevet enhet. Denne artikkelen vil konsentrere seg om AC confocal mikroskopi metoder og hvordan de er visualisert i vitro og vivo fra lunge prøver.
Abstract
En primære metoden brukes til å definere tilstedeværelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er AC confocal mikroskopi. Vi har endret etablerte AC confocal mikroskopi metoder for å visualisere macrophage ekstracellulære feller (METs). Disse ekstracellulære feller er definert ved tilstedeværelse av ekstracellulære chromatin med co uttrykk for andre komponenter som granule proteaser, citrullinated histones og peptidyl arginase deiminase (PAD). Uttrykk for METs er vanligvis målt etter eksponering for en stimulans og forhold til FN stimulert prøver. Eksempler er også inkludert for bakgrunnen og isotype. Celler analyseres ved hjelp av veldefinerte analyseprogramvare. AC confocal mikroskopi kan brukes til å definere tilstedeværelsen av METs både i vitro og vivo i lungevev.
Introduction
Nøytrofile ekstracellulære feller (nett), ble først beskrevet av Brinkmann et al. 1 de er hovedsakelig produsert i respons på infeksjon (spesielt til bakterier) og har en viktig rolle i vert forsvar1,2. De har også blitt beskrevet i svar på ikke-smittsomme sykdommer, inkludert vaskulitt og systemisk lupus erythematosus (SLE); og den mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetate (PMA)2,3. Det har nylig blitt anerkjent at andre celletyper kan produsere ekstracellulære feller, inkludert makrofager. Macrophage ekstracellulære feller (METs) er ennå ikke en veldefinert enhet i litteratur4,5. Vi har nylig etablert metoder for å oppdage tilstedeværelsen av METs både i vitro og vivo6,7. I denne artikkelen beskrives måling av METs bruker AC confocal mikroskopi.
Nøkkel vise egenskaper av NETosis som skiller den fra andre cellulære veier (for eksempel apoptose8) er byggesystemer i chromatin i forbindelse med: (1) citrullination histones (H3Cit)9, (2) co uttrykk for granule proteaser10 , og (3) involvering av peptidyl arginine deiminase (PAD) 411,12. Makrofager uttrykker også H3Cit og granule proteaser PAD, og disse funksjonene kan brukes til å definere tilstedeværelsen av METs.
METs kan ha en spesielt viktig rolle i lungene, som macrophage er dominerende cellen i alveoler og luftveiene i lungene og har innledende rolle i regissere mobilnettet immunforsvaret til infeksjon/betennelse. Dessuten, mens mye av lungene er tom plass (f.eksi alveoler), er METs potensielt kunne utvide til plass, i motsetning til solide organer.
Den mest brukte metoden til å definere tilstedeværelsen av garn er AC confocal mikroskopi. Det er ikke ennå en klart definert måte å måle METs. Teknikk for måling av garn er tilpasset å måle tilstedeværelsen av METs i denne protokollen. Det hovedavdeling behov for denne metoden er tilgang til AC confocal mikroskopi og riktig programvare for analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne anmeldelsen er basert på som brukes til å definere tilstedeværelsen av garn14. Makrofager er langt den dominerende celle typen i BAL prøver denne metoden av samlingen er spesielt egnet for å studere METs. Hvis røde blod celler finnes i BAL, skal disse cellene bli lysed ved hjelp av salmiakk. BAL prosedyren vil vanligvis aktivere makrofager og derfor er det forventet at det vil være METs i un stimulert prøver. BAL makrofager er vanligvis svært tilhenger. BAL makro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Monash University, National Health og Medical Research Council, og Monash lunge og sove Institute. Forfatterne ønsker å takke ansatte i klinisk immunologi ved Monash helse, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass og Camden Lo av Monash mikro Imaging (MMI) for hjelp med AC confocal mikroskopi imaging, og forfatterne erkjenner MMI fasiliteter Monash University. Forfatterne bekrefter fasiliteter, og vitenskapelig og teknisk assistanse av Monash Histology plattformen.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
